梨果黑斑病菌AaCaMK基因克隆、生物信息学分析及其在侵染结构分化中的表达分析

[背景] 钙/钙调素依赖型蛋白激酶（Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase,CaMK）是真核生物细胞钙信号途径中钙调素下游的一类重要靶蛋白,对病原物生长、胁迫响应及致病性等具有重要的调控作用。[目的] 对梨果黑斑病菌互隔交链孢（Alternaria alternata）AaCaMK基因进行克隆、生物信息学分析,并对其在侵染结构分化过程中的基因表达情况进行分析,为进一步研究梨果黑斑病菌钙离子信号途径中AaCaMK对A.alternata侵染结构分化调控的分子机制提供一定的理论依据。[方法] 采用同源克隆法从A. alternata JT-03中克隆得到3个AaCaMK基因;通过TMHMM、ProtScale、SOPMA等软件对AaCaMK基因进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR （RT-qPCR）技术分析AaCaMK在梨果黑斑病菌侵染结构分化过程中的表达情况。[结果] 克隆得到片段分别为1 212、1 200、2 349 bp的AaCaMK1、AaCaMK2和AaCaMK3基因;生物信息学分析表明,AaCaMK1、AaCaMK2和AaCaMK3均含有典型的蛋白激酶超家族催化结构域（PKC_Like Superfamily）,并且AaCaMK1和AaCaMK2共同含有CaMK类丝/苏氨酸蛋白激酶催化结构域（STKc_CaMK）,AaCaMK3含有LKB1/CaMKK类丝/苏氨酸蛋白激酶催化结构域（STKc_LKB1_CaMKK）;同源性分析表明,AaCaMK1、AaCaMK2和AaCaMK3分别与玉米大斑病菌CAK1、CAK2和CAK3的相似性高达94.32%、97.49%和86.57%;RT-qPCR分析表明,AaCaMK1、AaCaMK2和AaCaMK3在疏水及果蜡诱导A. alternata侵染结构分化过程中均显著上调表达（P<0.05）,而且果蜡诱导作用更显著。其中AaCaMK1和AaCaMK2在附着胞形成时期（6 h）表达量为对照的1.51倍和3.05倍,而AaCaMK3在侵染菌丝形成阶段（8 h）表达量最高,为对照的2.86倍,并且在果蜡诱导下,这3个基因在芽管伸长阶段（4 h）的上调表达量显著高于疏水界面。[结论] 钙信号中AaCaMK基因在疏水及果蜡诱导A.alternata侵染结构分化过程中发挥重要的调控作用。     

梨果黑斑病菌互隔交链孢(Alternaria alternata) hnr基因的克隆及其对侵染结构分化的调控

【背景】羟基萘还原酶(hydroxynaphthalene reductase,HNR)是1,8-间苯二酚(1,8-dihydroxynaphthalene,DHN)黑色素合成途径中起关键作用的酶,研究表明HNR不仅参与真菌黑色素合成,而且对其生长发育及致病性也具有一定的调控作用,但HNR对真菌病原物侵染结构分化的调控研究鲜见报道。【目的】在对梨果黑斑病菌互隔交链孢(Alternaria alternata) HNR的基因进行克隆与生物信息学分析的基础上,通过药理学方法初步探讨HNR对A.alternata生长及侵染结构分化的调控作用,为进一步揭示HNR在A.alternata侵染结构分化形成过程中的分子机制提供理论依据。【方法】对梨果黑斑病菌A.alternata的2个hnr基因进行了克隆;通过gene structure display server、open reading frame (ORF) Finder及conserved domain search等数据库及相关软件,对hnr基因及蛋白进行生物信息学分析,并利用HNR特异性抑制剂三环唑处理分析其对A.alternata生长发育、黑色素合成和侵染结构形成的影响,同时采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)技术分析了hnr基因在A.alternata不同侵染结构分化时期的表达特性。【结果】从梨果黑斑病菌A.alternata克隆得到2个羟基萘还原酶基因hnr的编码区全长,分别命名为Aa4hnr和Aa3hnr,其中Aa4hnr基因全长为1 266 bp,编码了268个氨基酸,无内含子,有9个ORF;Aa3hnr基因全长为1 356 bp,编码了267个氨基酸,含有2个大小分别为51 bp和49 bp的内含子,有17个ORF;进化分析表明,Aa4hnr和Aa3hnr与Ophiobolus disseminans和Alternaria arborescens分别具有较高的一致性,同时Aa4hnr和Aa3hnr编码的蛋白均含有NAD (P)结合域,属于短链脱氢酶/还原酶(short-chain dehydrogenase/reductase,SDR)家族。药理学结果表明,三环唑处理显著降低了A.alternata DHN黑色素的生物合成,抑制了疏水性诱导的A.alternata侵染结构的形成;进一步分析Aa4hnr和Aa3hnr在疏水表面诱导的A.alternata孢子萌发阶段(2 h)、附着胞形成阶段(6 h)、侵染菌丝形成阶段(8 h)的基因表达量,Aa4hnr的基因表达量在A.alternata侵染结构分化的各个时期均发生下调,Aa3hnr在附着胞形成阶段(6 h)表达量下调,然而在侵染菌丝形成阶段(8 h)显著上调表达。【结论】Aa4hnr和Aa3hnr对梨果黑斑病菌侵染具有一定的调控作用。     

基于核心技能培养的中医院校生物技术综合性实验体系的建立

本研究以黑龙江中医药大学生物技术专业学生为研究对象,通过建立开放型综合性生物技术制药实验平台,开展以中药抗肿瘤生物技术药物生产为主要方向的综合性实验研究,结果表明:通过该研究后学生在理论知识的掌握、实验设计能力、创新能力及科研论文的写作能力上都比对照组学生有较大提高,为实现培养创新型生物技术制药人才的教学目标奠定基础。     

《食品生物技术》课程优化研究

本文结合了《食品生物技术》课程实际,对《食品生物技术》课程的优化提出了相关措施,希望对《食品生物技术》课程教学提供一定的参考。