以柞蚕NPV为载体在柞蚕蛹体内表达外源基因获得成功

辽宁省农科院大连生物技术研究所张春发等人利用柞蚕核型多角体病毒(ApNpV)组建成转移载体,并以此载体携带外源基因(人白细胞介素-4、DE糖蛋白)在草地贪夜蛾Sf9昆虫细胞、柞蚕卵巢细胞以及柞蚕蛹活体中表达成功。实验表明,表达产物的确以非融合蛋白形式出现,从而建立了柞蚕NpV载体—柞蚕蛹活体宿主表达系统。这是继菌苜蓿纹夜蛾核多角体病毒(AcNpV)—Sf9细胞载体表达系统和家蚕核多角体病毒(BmNpV)——家蚕幼虫载体表达系统以后又一个昆虫杆状病毒载体达表系统。由于该系统是利用柞蚕蛹活体为宿主     

丫纹夜蛾核多角体病毒转移载体质粒的组建

自从美国G.E.Smith等发展苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus,简称Ac NPV)这一新的表达载体以来,先后已有几个外源性基因成功地获得了高效表达。如:人白细胞间素2(Interleukin 2)、人的c-myc基因产物、流感病毒血凝素等。与目前常用的原核和真核细胞表达系统比较,NPV载体     

β—1，3葡聚糖酶与糖体失活蛋白融合基因的制备及表达载体的构建

将大豆的β－1,3葡聚糖酶基因与玉米的核糖体失活蛋白基因通过一个6个氨基酸的柔性短肽链连接起来,形成1个融合蛋白。编码区基因长1830bp,共编码609个氨基酸和1个终止密码子。经过使用蛋白质分析软件Antheprot4.3和Prosis(v5.00）对融合蛋白的二级结构、理化特性、潜在信号肽断裂位点等方面进行分析表明：融合蛋白较好的保持了原来的两个蛋白的各项理化特性,维持了两种蛋白的二级结构。将此基因克隆质粒PBI121上,构建成植物表达载体PBI／GR。     

柞蚕核多角体病毒核多角体基因的定位和克隆

通过Southern转印杂交证明,柞蚕核多角体病毒(Antheraea pernyi nuclear polyhedrosis virus,ApNPV)核多角体基因位于该病毒基因组DNA Bam HⅠ D和E片段上,我们巳将这两个片段分别克隆到pAT153质粒中,并用末端杂交法确定了ApNPV核多角体基因的方向,对含有这一基因的片段进行了限制性内切酶图谱分析,进而对这一基因部分编码区进行了核苷酸序列分析,在用ApNPV这一段序列(222bp)与其他昆虫核多角体病毒AcNPV(AutograPha californica NPV,苜蓿丫纹夜蛾NPV);BmNPV(Bombyx mory NPV,家蚕NPV);OpNPV(Orqyia Pseudotsugata NPV,黄杉毒蛾NPV)核多角体基因相应区段相比较分析中,发现它们之间的同源核苷酸序列比率分别为77.5％、84％和80％。     

柞蚕核型多角体病毒多角体蛋白基因上游5''''端核苷酸序列分析

核型多角体病毒(Nuclear Polyhedrosis Virus,简称NPV)的核多角体蛋白(Polyhedrin)基因具有一个非常强的启动子和基因调控序列。目前利用这一基因的上述序列已组建了多种表达载体,高效地表达了十几种外源基因产物,成为当前最有前途的新的表达系统。但是,在组建这一病毒载体过程中,为了使插入的外源基因靠近病毒启动子序列,各     

柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)转移载体质粒pAp M2614的组建

自从美国科学家G.Smith等首次建立苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcNPV)转移载体表达系统以来,已被广泛用于外源基因的表达,成为世界上一新的具有巨大潜力的载体表达系统。为了进一步提高表达产量,降低成本,日本科学家前田进建立了家蚕核型多角体病毒(BmNPV)载体表达系统,并获得了高效表达。柞蚕是我国特产,以蛹滞育越冬,保存时间长,个体大,可工厂化生产。因此,组建柞蚕NPV转移载体,进而建立该载体表达系统,是目前利用昆虫活体为宿主进行外源基因表达较理想的昆虫杆状病毒载体表达系统。     

玉米核糖体失活蛋白基因的克隆及序列分析

将提取的玉米RNA反转录成Cdna,以此为模板,合成特异性引物,应用多聚酶链式反应(PCR)技术扩增出目的片段。对PCR片段直接进行序列分析,测定并克隆玉米的核糖体失活蛋白(RIP)基因。序列分析表明,已测定的玉米RIP基因序列长为983bp,其中编码区长828bp,共编码有275个氨基酸和一个终止密码子,GC含量为58.3%。与已发表的序列相比较其核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为98.4%和97.4%。