人源Fank1蛋白质FN3结构域多肽的原核表达，纯化及晶体筛选

目的纯化人源Fank1（fibronectin type Ⅲ and ankyrin repeat domain1）蛋白质N端FN3（fibronectin typeⅢ,Ⅲ型纤黏连蛋白）结构域蛋白,用于晶体生长的三维结构分析。方法将FN3结构域基因片段克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,将菌落PCR和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21（DE3）后获得表达菌株。该菌株经IPTG诱导高效表达出带有GST标签的可溶性的融合蛋白,经过Glutathione Sepha-rose^TM 4B亲和层析、Hiload16／60 superdex200分子筛层析纯化后,蛋白纯度达到95％以上。结果纯化蛋白采用悬滴气相扩散法得到棒状晶体。结论成功制备了高纯度FN3蛋白,获得FN3蛋白质晶体,为进一步的三维结构解析及Fank1功能研究奠定了基础。     

一部难得的工具书

分子生物学作为当前生命科学最重要的前沿学科,已深刻影响并渗透到生物医学研究的各个领域。广大生物、医学研究人员,研究生和技术人员迫切需要有关的研究技术、方法和数据资料的手册,以便随时查阅。近年来,国内外相继出版了多种分子生物学实验技术手册,但却很少见到有关的常用数据资料手册。许多内容常常分散在不同的著作或资料中,因此要查询有关数据仍然相当困难。令人兴奋的是吴冠芸、潘华珍和吴　三位老教授集其数十年生物化学与分子生物学研究之经验,组织了一批活跃在生化和分子生物学研究第一线的中青年科技工作者,不辞辛劳编辑了一部…     

编码人精子膜蛋白YWK-Ⅱ基因在人睾丸组织表达的研究

抗人精子膜蛋白的单克隆抗体YWK-Ⅱ,能引起人精子凝集和抑制体外穿卵,并发现在睾丸组织中至少有4种形式的mRNA对应于YWK-Ⅱ抗原,可能是同一基因转录而不同方式剪切的产物.从人睾丸λgt10 5’Stretch cDNA文库中筛选,得到1个4kb大小的cDNA,命名为 C211.在 C211的 5’变异区和 3’相对稳定区中选择了2段.DNA分别作为转录探针的模板,5’端为943 bP和3’端为1.5kb的片段,将以上二个片段与含SP6和T7启动子的PGEM3Z载体进行重组,采用体外转录,地高辛标记的方法,分别合成2,tRNA探针,对人睾丸组织进行原位杂交.人睾丸YWK-ⅡC211基因片段地高辛(Dig)标记的5’端和3’端Antisense cRNA探针均与支持细胞质中的mRNA杂交,证明YWK-Ⅱ抗原蛋白在Sertoli细胞中合成,并又镶嵌在生精细胞膜上,最终定位于精子头部赤道极.     

一种抑制pGEX载体系统本底表达的方法

用pGEX载体系统体外构建了一种人精子膜蛋白片段（HSDⅡ）的重组表达质粒.未经IPTG诱导,该质粒表达的融合蛋白在DH5α中即有较高的本底表达量.若将带有LacⅠ基因的pREP4质粒与重组表达质粒共转化DH5α菌,则可有效抑制融合蛋白的本底表达.