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从伪狂犬病病毒中删除Cre/LoxP介导的报告基因 总被引：1，自引：0，他引：1
根据pEGFP-C1序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出两端各含一个同向LoxP位点的GFP表达盒,克隆于转移载体pSKLR获得pSKLR-G-LoxP。通过经典同源重组方法,得到表达GFP的TK基因缺失伪狂犬病毒重组毒株S03109。该重组病毒在转染了pOG231(表达Cre重组酶)的293T细胞上连续传代,筛选得到重组病毒株S0419。荧光显微镜观察、Western blot及PCR检测结果表明,S03109感染细胞后持续表达GFP,而S0419不表达GFP。PCR证实S0419为含单个LoxP位点的TK基因缺失病毒,并且在细胞培养上遗传稳定,测序结果(GenBank登录号AY822465)表明,在Cre重组酶的作用下,两个同向LoxP序列之间的GFP表达盒被正确除去。对BALB/c小鼠的半数致死量(LD50)及免疫保护实验结果表明,S03109和S0419对BALB/c小鼠的LD50值均大于3×105PFU,免疫BALB/c小鼠,攻毒后平均存活率分别为67.5%与70%。以上结果表明,利用Cre/LoxP位点特异性重组系统,成功去除了插入重组伪狂犬病病毒基因组中的GFP报告基因。 相似文献
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根据GenBank已发表的pEGFP－C1序列,设计并合成两对引物,PCR扩增出两端各含一loxP位点的GFP表达盒GFP-loxP。克隆于转移载体pSKLR获得pSKLR-GFP-loxP。基于同源重组原理, pSKLR-GFP-loxP与 PRV SH株基因组DNA共转染293T细胞,在BrdU 的筛选压力下,利用蚀斑法在TK-143细胞上筛选出表达GFP的TK基因缺失的重组毒株rPRV1。将表达Cre酶的质粒载体pPOG231与rPRV1基因组DNA共转染293T细胞,在Cre酶的作用下去除GFP表达盒以及一个loxP位点,筛选得到含单个loxP位点的重组病毒株rPRV2。PCR 扩增证实所获得的重组病毒TK缺失270bp,只有一个34bp的loxP位点,并且能在RK-13细胞上稳定传代。LD50试验表明rPrV2的毒力下降。 相似文献
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猪流行性腹泻病毒嵌套式RT-PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一种以呕吐、腹泻和失水为特征的猪肠道传染病.各种年龄的猪都可发病[1],哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的发病率最高可达100%,尤其哺乳仔猪的受害最严重.本病在欧洲许多国家均有报道.上海畜牧兽医研究所等单位证实,我国近年来发生的仔猪腹泻,有很多为PEDV引起. 相似文献
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