肺炎链球菌去信号肽脂蛋白PsaA锌离子结合特性的初步表征

肺炎链球菌是细菌性肺炎的主要病原体。PsaA是各种肺炎链球菌共有的遗传保守的特异性表面金属结合脂蛋白。通过PCR扩增肺炎链球菌D39不含信号肽的PsaA基因片段,将其通过T4连接酶连接至含6His标签的表达载体PBAD/HisA中,转化表达宿主大肠杆菌Top-10后用L(+)-阿拉伯糖诱导重组蛋白的表达。重组蛋白经亲和镍柱纯化以后,用外切酶-重组肠激酶(REK)去除6His标签。感应偶合电浆质谱(ICP-MS)测得纯化的PsaA蛋白以1:1比例结合金属锌离子。进而,通过圆二色谱法分析金属离子的结合对蛋白二级结构中α-螺旋和β-片层含量的影响,荧光光谱研究蛋白结合锌离子的解离常数及结合当量,为进一步研究该蛋白在体外的金属结合特性及细菌的金属运输及毒力机制提供理论基础。     

化脓链球菌中铁结合蛋白MtsA二级结构的研究

化脓性链球菌是一种革兰氏阳性人类致病菌,其生长和感染离不开铁离子。MtsA是化脓链球菌中直接结合铁离子的一个脂蛋白。通过PCR扩增化脓性链球菌MGAS5005中的MtsA基因,构建高效表达质粒pGEX-MtsA,将其转化到大肠杆菌BL21中并用IPTG进行诱导表达。利用亲和层析方法纯化表达产物。通过多序列比对分析了MtsA铁结合中心的保守性,利用定点突变技术将MtsA的结合配体单位点及多位点进行突变,结合圆二色谱分析这些氨基酸突变后蛋白二级结构的变化。多序列比对结果表明MtsA结合铁离子的氨基酸位点是保守的,4个关键氨基酸位点处于蛋白空间的凹陷处。通过比较空载及饱和铁离子的野生型蛋白以及突变体蛋白的圆二色吸收光谱,发现野生型MtsA结合铁离子后结构更加紧密,H68A,E206A和D281A则比野生型的二级结构松散,而H140A的二级结构和野生型的几乎没有差别。对MtsA 4个结合配体突变后其二级结构变化的研究,为进一步研究细菌中的铁转运机理及开发疫苗候选药物和药靶奠定了一定的理论依据。     

化脓性链球菌脂蛋白FtsB的基因克隆、表达、纯化与功能研究

体外克隆化脓性链球菌5005的tsb基因,表达并纯化FtsB蛋白,并对其铁色素结合特性进行初步研究.首先通过PCR方法从基因组中扩增ftsb基因,将其连接到pGEX4T-1载体上,转入大肠杆菌DH5a中大量扩增,将测序正确的重组载体转化到表达宿主大肠杆菌BL21进行表达,优化诱导表达条件.利用亲和层析方法纯化表达产物,并对FtsB的铁色素结合特性进行研究,同时通过DEPC封闭组氨酸实验对其结合位点进行初步研究.成功构建原核表达载体pGEX-ftsb,获得分子量约33 kD的野生型FtsB蛋白,产率为30 mg/L.紫外-可见光谱研究表明FtsB和铁色素结合后在450 nm处出现紫外吸收峰,DEPC封闭组氨酸实验证明FtsB中组氨酸不参与铁色素的结合.对FtsB蛋白进行铁色素结合特性和结合位点进行研究,为进一步研究细菌中的铁色素转运机理及开发疫苗候选物和药靶奠定一定的理论基础.     

应用蛋白质组学的方法分析缺铁培养对化脓性链球菌MGAS5005的影响

【目的】研究铁缺失对化脓性链球菌的影响,并寻找摄铁系统中的关键蛋白。【方法】以化脓链球菌为模型,利用含Fe和不含Fe的培养基对细菌进行培养,收集全细胞蛋白进行双向电泳,定量软件分析电泳图谱,质谱鉴定差异蛋白,进而通过生物信息学分析蛋白上下游关系,从中找到关键蛋白。【结果】鉴定出20个差异蛋白,并用Cytoscape软件对差异蛋白相互关系网络进行节点分析找到其中5个瓶颈分子。【结论】在培养基中的Fe3+缺乏时,细菌的生物合成和含氮化合物、生物大分子等重要代谢受到很大影响,这为进一步阐明细菌铁代谢机制奠定了基础。