铁皮石斛DoWRKY6转录因子基因的克隆与分析

目的:植物生长发育由多种转录因子调控,探索WRKY转录因子调控铁皮石斛组织生长发育机理。方法:根据铁皮石斛原球茎转录组数据中的WRKY6序列设计引物,并利用RACE技术克隆该基因;用生信分析软件预测其蛋白结构,并进行系统发育分析;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术研究该基因在铁皮石斛幼苗根、茎、叶等组织中的表达。结果:通过RACE技术得到1个1,238bp的Ⅱ类WRKY转录因子基因,命名为DoWRKY6,其ORF长1,017 bp,编码339个氨基酸残基,与梅[PrmuWRKY27(XM_008236601.1)]及大豆[GlmaWRKY27(XM_003555347.3)]有较近的亲缘关系,且DoWRKY6在茎中的相对表达量最大。结论:我们预测在铁皮石斛的生长发育过程中DoWRKY6基因对根、叶、茎的调控作用依次增强,表明DoWRKY6与已发表的铁皮石斛WRKY基因在组织的差异性表达上有较大差别,这对丰富WRKY家族对铁皮石斛的生长发育调控机制提供更多依据。     

决明胰蛋白酶抑制剂1活性相关残基的定点突变与抑制活性分析

决明胰蛋白酶抑制剂1（CoTI1）属于Kunitz胰蛋白酶抑制剂家族成员,通过序列比对预测Arg86、Leu84和Thr88等3个氨基酸残基可能是CoTI1发挥抑制作用的关键残基。通过定点突变的方法将Arg86、Leu84与Thr88残基分别突变为Asp残基,并考察各突变体对胰蛋白酶及棉铃虫等鳞翅目害虫消化酶的抑制作用。与CoTI1相比,CoTI1^R86D、CoTI1^T88D与CoTI1^L84D突变体对胰蛋白酶的抑制活性分别下降了93%、64%与59%;对棉铃虫、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾等3种鳞翅目害虫消化酶的平均抑制活性分别下降了88.7%、57%与60.7%。以上结果表明Arg86、Leu84与Thr88是CoTI1发挥抑制作用的关键残基,这为CoTI1的抑制分子机制及抗虫研究提供了重要的理论依据。     

烟草抗CMV突变体的抗病性分析

在突变体植株“Ea201主、Ea201侧、Aa201侧”的5～6叶期接种CMV汁液,并按优选法去除病症最严重的病株,6周后将剩余植株分别移栽到田间露地和防虫网内,到盛花期分别统计植株的感病情况。其结果为：在田间露地和防虫网内,①感病的对照品种的植株高度只及健康的对照植株高度的30％和40％,突变体的则可达到70％和80％;②对照品种的植株感CMV的病情指数可达90％和50％,突变体的则只有30％和3％;③对照品种植株感TMV的病情指数可达60％和30％,突变体植株感TMV的病情指数只有30％和10％;④突变体植株群体中有症状回复现象,同时其育性不受任何影响。从而表明所筛选到的烟草突变体“Ea201主、Ea201侧、Aa201侧”对CMV、TMV的相对抗性较好,具有较高的抗病性。     

~（60）Coγ射线照射烟草花药获得抗黄瓜花叶病毒（CMV）的突变体植株

取小孢子处于单核靠边期的烟草８６１１、Ｋ３２６、ＮＣ８９花蕾,经４℃预处理４８小时后用不同剂量的￣（６０）ＣＯγ射线辐射,将花药接种于Ｈ培养基中诱导出单倍体植株,并经壮苗培养,移栽成活后,在幼苗新叶上摩擦接种黄瓜花叶病毒病（ＣＭＶ）汁液,经过９２天的选择、淘汰,分别在ＮＣ８９、８６１１植株群体中筛选得到了各２株、１株抗ＣＭＶ的突变体植株。     

拟南芥LEC同源基因的生物信息学分析

用生物信息学方法对拟南芥叶状子叶(LEC)基因的核苷酸序列以及推导氨基酸序列的组成、功能结构域、亲水性等进行了分析。结果表明,拟南芥的LEC蛋白为位于细胞核中的亲水性不稳定蛋白;通过对LEC蛋白的功能结构域的分析发现,LEC1和L1L蛋白中高度保守的区域即为CBF-NFYB-HMF结构域,LEC2和FUSCA3蛋白中高度保守的区域为B3结构域。     

小麦叶片愈伤组织及其再生植株的诱导

小麦幼苗基部外植体在补加２,４－Ｄ的ＭＳ、Ｎ６、ＢＡ１（３）培养基上均可诱导出愈伤组织,２,４－Ｄ的最适浓度为２．０ｍｇ／Ｌ;愈伤组织的增殖速度与切段部位及基本培养基有关,其中在以ＭＳ补加２．０ｍｇ／Ｌ２,４－Ｄ的培养基上诱导出的愈伤组织增长速度最快;最后讨论了小麦愈伤组织幼苗诱导率低的原因及可能解决的方法。     

铁皮石斛泛素结合酶DoUBC9的克隆鉴定与表达分析

目的:本研究旨在探讨泛素结合酶UBC9在铁皮石斛原球茎发育过程中的分子机制,方法:利用生物信息学手段,从已获得的铁皮石斛基因组中鉴定出UBC9基因,命名为DoUBC9,并利用RACE技术,克隆出DoUBC9 3’端,通过与基因组序列拼接,获得完整序列。结果:本研究首次从铁皮石斛基因组中运用生物信息学的方法,鉴定出DoUBC9,并通过RACE技术克隆后拼接,得到完整的DoUBC9,基因全长为7176bp,CDS长为447bp,共编码148个氨基酸。亚细胞定位预测结果表明,DoUBC9大概率分布于分泌囊泡和质膜上。序列比对和进化树分析表明,铁皮石斛Do UBC9和其他物种中的UBC9拥有高度保守的UBCc结构域,进化关系高度保守。qRT-PCR分析表明,在不同组织部位中,DoUBC9在愈伤组织中的表达量最高、叶中表达量最小;在原球茎发育过程中,在P1时期具有最高表达量,其他各时期表达量较小,表明该基因可能促进了植物体的细胞快速分裂与生长。结论:通过分子建模方式,首次构建出DoUBC9蛋白的基本模型,并通过不同的评价方式确定了以人泛素结合酶E2 H结构(2Z5D)为模板的为最优模型。     

铁皮石斛尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆与分析

目的:研究尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)在铁皮石斛不同组织中的表达情况,探讨其与石斛多糖累积的关系。方法:根据铁皮石斛原球茎转录组数据中的DoUGPase1序列设计引物,并利用RACE技术克隆该基因;用生信分析软件预测其蛋白结构,并进行系统发育分析;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术研究该基因在铁皮石斛不同年份,不同组织中的表达。结果:通过RACE技术得到1个3054 bp基因,命名为DoUGPase1,其ORF长1530 bp,编码510个氨基酸残基,与油棕(Elaeis guineensis)和波斯枣(Phoenix dactylifera)有一定的同源性,且DoUGPase1在3年生的植株中相对表达量整体较高(P0.05)。结论:我们预测在铁皮石斛的生长发育过程中DoUGPase1基因与多糖累积的活跃程度成正比例。     

烟草叶外植体不定芽的诱导

烟草花药单倍体试管植株Nc89、Nc82、6186,取其完全展开之叶片,切成5mm×5mm大小的叶块,将之接种于补加BA(2mg/L)、蔗糖(5%)、琼脂(0.55%),pH5.8的MS培养基中,然后将其置于23—25℃、12h/d光照的培养间中培养,大致经过14—18天后,在叶外植体边缘部分出现了肉眼可见的绿色小芽,待芽长至约5mm大小时,将其从外植体上分离并置于含1/2 MS大量元素、全量MS微量元素、铁盐及有机物质,并补加KH_2PO_4(50mg/L)、IAA(1mg/L)、蔗糖(3%)、琼脂(0.55%),pH5.8的过渡生根培养基中,待3个星期后芽已长出了3片小叶时再将之转移到含1/2 MS大量元素、MS全量铁盐,并补加IAA(1 mg/L)、蔗糖(1%)、琼脂(0.55%),pH5.8的生根培养基上,5—6天后芽上基部有小根出现,再经过两个星期,试管苗长出了较发达的根系。待其长至3cm—4cm高时,移栽入土,移栽后试管苗成活率高,苗长势很好。     

铁皮石斛SPL膜结合(STM)转录因子的全基因组鉴定及表达分析

SPL转录因子广泛参与植物生长发育、胁迫响应等过程。目前,没有关于铁皮石斛SPL膜结合(SPL with transmembrane motif)转录因子即STM转录因子的研究。为了探究STM转录因子在铁皮石斛生长发育及胁迫响应等方面的作用,该文在铁皮石斛全基因组水平鉴定出4个STM转录因子,并对DoSTM基因家族成员进行生物信息学分析,又利用逆转录PCR研究了DoSTM在不同组织部位及不同逆境处理下的表达情况。结果表明:(1)DoSTM1-4为亲水蛋白,均具有SBP保守结构域和一些激素响应位点。(2)4个DoSTM在根茎叶中均有表达,DoSTM2在叶中的相对表达量最低; DoSTM1/3/4的相对表达水平均无明显差异。(3)DoSTM1-4在低温、高温、干旱胁迫下的相对表达水平都有显著变化,DoSTM1/3/4的表达量降低最为明显,故推测DoSTM与植物体内激素响应、温度变化响应及抗旱性有关。这些结论为后续进一步开展铁皮石斛STM转录因子的研究提供了参考。