葡萄溃疡病菌限制性内切酶介导整合方法的建立及转化子库的构建

[目的]摸索葡萄溃疡病菌(Lasiodiplodia theobromae)限制性内切酶介导整合(Restriction enzyme mediated integration,REMI)的转化方法,并构建CSS-01s (L.theobromae)的REMI转化子库.[方法]利用REMI转化方法,将线性化的含有潮霉素抗性基因(Hygromycin phosphotransferase gene,Hyg)的pUCATPH质粒转化CSS-01s菌株的原生质体;测定其对潮霉素B的敏感浓度,摸索不同酶解液和酶解时间对原生质体制备的影响,统计不同限制性内切酶酶量对转化效率的影响,以摸索出的最优条件构建CSS-01s菌株的REMI转化子库,采用Southern blot的方法验证转化子.[结果]首次建立了一套L.theobromae的REMI转化方法,经转化得到包含6 000余个转化子的L.theobromaeCSS-01s转化子库,随机挑选的5个转化子经Southern blot分析,质粒均插入到了Hind Ⅲ相应的酶切位点处.[结论]浓度为2％崩溃酶+2％蜗牛酶酶混合液、酶解4h为原生质体获得的最优条件,每管转化体系中加入30 UHind Ⅲ时转化效率最高,该方法可以用来获得大量不同表型的REMI转化子.