HIV-1假病毒包装的重要影响因素分析

[目的]分析影响HIV-1假病毒包装的主要因素,建立该假病毒包装的优化条件.[方法]用单因素分析对比的方法,比较了对病毒包装效果有重要影响的转染试剂、转染试剂与质粒的数量、培养基血清类型、细胞周期阶段对于病毒包装效果的影响.[结果]对45批150盘病毒包装结果分析显示,使用PEI转染试剂成本低,转染效果好,其N/P在8-40均可以产生高活性的包装病毒;用进口血清包装时,相对于国产血清结果重复性高;细胞周期处于S及G2/M期时转染质粒相对于S以及G0/G1期有较高的病毒活性.[结论]用PEI为转染试剂可以包装出高活性的病毒,包装获取高活性病毒可以通过质粒与PEI梯度比例以及血清类型构成多个组合策略来实现.     

稳定表达HLA-A33蛋白细胞系的建立

旨在构建能稳定表达HLA-A33蛋白的细胞系,并观察其在细胞中的表达水平.首先克隆取得HLA-A33基因,并将其插入慢病毒载体,经酶切和测序鉴定,确定载体构建正确.通过慢病毒系统感染正常RD细胞,将HLA-A33基因整合进RD细胞的基因组.提取构建细胞系的基因组做PCR鉴定,并通过免疫荧光和蛋白免疫印迹法检测,结果显示,HLA-A33基因成功整合入RD细胞基因组中,且在重组细胞系中成功表达.该细胞系可为A33等位基因与HBV感染后的慢性化以及EV71感染的相关研究提供试验参考.     

HIV gp41七肽重复区五螺旋蛋白的高效表达及对病毒融合的抑制

人工构建的五螺旋蛋白(5-helix)能抑制人类免疫缺陷综合症病毒(HIV)介导的膜融合过程中发卡三聚体的形成,从而抑制病毒感染靶细胞。但5-helix基因在原核细胞中直接表达时易形成包涵体,复性困难,给研究带来不便。本研究探讨了将蛋白结构模拟用于寻找合适的表达载体的方式:通过同源建模,模拟了5-helix在pGEX-6P-1载体及pET44b载体上的融合蛋白形成的最有可能的2种构象。通过对比发现其在pET44b载体中与NusA的融合蛋白的溶剂化能远大于其在pGEX-6P-1中与GST融合蛋白的溶剂化能,且酶切位点位于蛋白表面。应用PCR将5-helix基因从pGEX-6P-1-5H克隆出来,鉴定正确后连接到pET44b载体上,构建成重组载体pET44b-PSP-5Helix。将重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3),于不同温度诱导表达。用镍柱及GST柱纯化蛋白,SDS-PAGE证实成功得到了目的蛋白。用纯化蛋白验证抑制HIV假病毒感染GHOST-CXCR4的活性。结果显示:与NusA融合的5-helix蛋白能够实现高效的可溶表达,且酶切容易;纯化蛋白抑制HIV假病毒感染GHOST-CXCR4的半数抑制浓度...