尼罗罗非鱼NCCRP-1基因的原核表达及条件优化

非特异性细胞毒性细胞受体蛋白(non-specific cytotoxic cell receptor protein 1,NCCRP-1)是一种在鱼类非特异性细胞毒性细胞(non-specific cytotoxic cell,NCC)活化过程起到关键作用的受体蛋白,也是NCC表面的一种分子标记。本研究根据NCBI上已公布的罗非鱼NCCRP-1基因序列,设计一对带酶切位点的引物,经PCR扩增、酶切、连接等步骤,构建罗非鱼NCCRP-1基因的原核表达质粒p GEX-NCCRP-1,将重组质粒导入至大肠杆菌BL21中,成功表达了NCCRP-1重组蛋白。对影响NCCRP-1表达的IPTG浓度、诱导时间、诱导温度等因素进行了优化,发现在20℃下,采用0.2 mmo I/L IPTG诱导5 h,可以诱导NCCRP-1可溶性重组蛋白的高效表达。而免疫印迹结果显示,经纯化后的重组蛋白可与GST-Tag单克隆抗体发生特异性反应,进而表明表达的重组蛋白是罗非鱼NCCRP-1蛋白。该结果为后续罗非鱼NCCRP-1的单克隆抗体制备以及NCCRP-1相关的功能研究奠定了重要基础。     

酶联荧光法测定失血性休克兔骨骼肌ATP含量

休克时全身血液供应不足,组织缺氧,三羧酸循环和线粒体呼吸链的功能受抑制,往往导致组织ATP的合成下降。因此测定休克时组织ATP的含量,可以反映细胞的能量代谢障碍。我们对G.Paul介绍的组织ATP测定方法在样品取材和试剂保存方面作了改进,并且测定了实验性失血性休克模型以及复苏条件下家兔骨骼肌组织ATP的含量。现将结果和方法报告如下。材料和方法一、材料成年家兔37只,性别不拘,体重2.0—3.0 kg。分为三组:假手术组11只;平衡盐液复苏组13只;平衡盐液 ATP-MgCl_2     

家兔失血性休克时细胞膜电位的变化及其可能机制

应用超微电极技术在体测定骨骼肌细胞膜电位(Skeletal Muscle Cellular Membrane Potential 简称SMCMP)可以直接反映和监测休克状态下细胞膜和细胞功能的改变,但是有关休克时SMCMP下降的机制尚有争议。本实验应用“半浮置”式玻璃超微电极技术在体测定SMCMP的实验方法,同时观测家兔失血性休克不同时相中SMCMP和血乳酸、SMCMP和骨骼肌组织ATP含量之间的相互关系,以期探讨休克时SMCMP的变化及其可能机     

β-葡聚糖刺激下的斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)转录组分析

斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)是一种重要的海水经济养殖鱼类,然而病害是制约其养殖产量的一个重要因素。近年来-葡聚糖作为一种新型的天然免疫增强剂在水产养殖业中得到广泛应用。本研究采用腹腔注射0.2 mL-葡聚糖(浓度0.05 g/mL)刺激斜带石斑鱼,在刺激6 h、72 h后分别取头肾、血液淋巴细胞、胸腺和脾脏组织进行转录测序。结果一共组装了175 568条unigene,平均长度是1 507 bp。通过Blast比对数据库进行功能注释,一共注释了121 629条unigene。六大数据库注释得到的unigene数量分别为:91 955条(Nt)、66 089条(Nr)、14 126条(GO)、24 018条(COG)、9 673条(KEGG)和54 148条(Swiss Prot)。根据基因差异表达分析筛选出6类免疫相关的显著性差异基因71个,涉及抗原加工呈递、细胞粘附分子、补体系统、细胞因子、模式识别受体和吞噬作用。对差异基因进行GO富集分析,筛选出免疫相关条目7条,包括免疫应答、B细胞受体信号通路、趋化因子受体活性、白细胞趋化性、趋化因子调节信号通路、白细胞介素-1受体绑定和溶酶体组份。随机挑选7个显著性差异的免疫基因进行qRT-PCR验证,验证结果与测序结果变化趋势一致。本实验结果为研究-葡聚糖调节鱼类免疫系统的作用机制提供数据参考。