圆红冬孢酵母新颖脂肪酸合酶的重组表达、纯化与活性检测

脂肪酸合酶(Fatty acid synthase,FAS)催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A反应生成脂肪酸,是油脂合成代谢途径中最重要的酶之一。在高产油脂的圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides中发现了一种新颖的FAS,它含两个亚基,与其他物种的FAS相比,具有独特的结构域组成,尤其是含两个酰基载体蛋白(ACP)结构域。由于ACP在脂肪酸合成反应中起辅因子作用,推测多个ACP有利于提高FAS的催化活性,为研究该FAS的生物化学和结构特征,构建了表达FAS两个亚基的载体,并转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),含pET22b-FAS1和pET24-FAS2质粒的重组菌株ZWE06可同时高表达两个亚基,经硫酸铵沉淀、蔗糖密度梯度离心和阴离子交换层析纯化,得到的重组FAS比活力达到548 mU/mg。纯化的FAS复合物可用于后续酶动力学和蛋白结构研究,且表达与纯化方法的建立对研究其他ACP的功能具有参考价值。     

一种遗传转化方法在海洋红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)中的应用

海洋红酵母作为一种产油微生物富含油脂和类胡萝卜素,但由于没有合适的遗传操作方法,无法对细胞反应器进行理性改进,阻碍了它的进一步发展。首先利用农杆菌介导转化成功构建了海洋红酵母的遗传操作平台。参考完成基因注释的圆红冬孢酵母基因组信息,分离其甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子,以基于圆红冬孢酵母密码子优化的潮霉素作为筛选标记,构建载体转化至农杆菌AGL1中,利用农杆菌介导转化成功得到潮霉素抗性表型正确的转化子,通过表型验证,基因型验证以及Western blot在蛋白水平验证,鉴定了hyg基因的有效表达,证明了外源抗性基因成功导入海洋红酵母菌株中,实现了海洋红酵母新的转化方法的建立。     

基于16S rDNA测序及培养基法探究虹鳟鱼贮藏优势腐败菌

为探究虹鳟鱼腐败机制,选取新鲜虹鳟鱼鱼片在0℃条件下进行贮藏。根据鱼肉样品的菌落总数和挥发性盐基氮(TVB-N)含量,确定虹鳟鱼鱼片的贮藏终点。利用传统培养基分离手段及16S rDNA高通量测序技术相结合的方法鉴定贮藏过程中的优势腐败菌。采用16S rDNA测序技术,对虹鳟鱼贮藏初期、中期及末期的腐败菌组成进行鉴定。16S rDNA高通量测序结果显示,贮藏末期的优势腐败菌属种类丰富,包括不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)和希瓦氏菌属(Shewanella)等多个菌属。利用培养基法分离的腐败菌为假单胞菌属及希瓦氏菌属,两者均包含在高通量测序菌属内。将分离到的这两个菌属接种到无菌虹鳟鱼鱼汁中进行贮藏,在贮藏过程中监测菌落总数及挥发性盐基氮含量,通过挥发性盐基氮产量因子评价优势腐败菌的致腐能力。腐败菌致腐能力结果显示,希瓦氏菌株S2的致腐能力最强。研究结果可为深入认识虹鳟鱼贮藏过程优势腐败菌提供依据,为进一步开发虹鳟鱼保鲜剂提供参考。     

重组酿酒酵母催化二氢大豆苷元生产雌马酚

雌马酚是大豆异黄酮的代谢产物,是一种天然的选择性雌激素受体调节剂,稳定性和生物学活性高。为实现雌马酚的微生物合成,采用模块途径工程策略,构建编码雌马酚合成关键酶基因 orf-1、orf-2和orf-3 的表达载体,成功用于转化酿酒酵母BY4741,得到工程菌株。结果表明,工程菌株有效表达了外源基因,并可将大豆异黄酮代谢中间体二氢大豆苷元转化为雌马酚。为构建从头合成雌马酚的微生物细胞工厂提供了重要科学参考。