单核细胞增生李斯特菌膜囊泡的制备及生物活性

【背景】细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是一种在自然界中普遍存在的包含生物学活性物质的囊泡状结构,其中包括革兰氏阳性菌分泌的膜囊泡(Membrane Vesicles,MVs)。近年来,单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)作为一种能产MVs的革兰氏阳性致病菌引起了众多科研人员的关注,尽管如此,对其MVs的了解仍然有限。【目的】建立健全Lm-MVs制备方法,同时深入了解其生物活性。【方法】以Lm野生菌株EGDe及其毒力突变株(EGDe△prfA、EGDe△prfA+pERL3-prfA*)为研究对象,利用超滤浓缩法和Optiprep密度梯度离心法提取Lm的MVs,并对这两种提取MVs的方法进行比较。此外,通过检测不同MVs对菌株生物被膜的影响,以及不同MVs的溶血活性和对棉铃虫的感染毒性来探究MVs的生物活性。【结果】相较于超滤浓缩法,Optiprep密度梯度离心法提取的Lm-MVs产率高、电镜观测效果好,但该方法操作相对复杂,耗时较长;不同毒力的Lm均可向外分泌直径20-200nm的MVs,而且MVs的形态结构与菌株的毒力无明显关系;但MVs可以影响菌株生物被膜的形成,具有一定的溶血活性,并能导致棉铃虫幼虫死亡或者降低其存活率和化蛹率,而且其毒性与菌株本身毒性正相关。【结论】Lm分泌的MVs极有可能直接参与了Lm对宿主的致病,并在细菌-细菌之间以及细菌-宿主相互作用中扮演了重要角色。研究结果将对进一步研究革兰氏阳性菌MVs的形成和功能以及Lm的致病机制具有重要意义。     

棉铃虫作为单核细胞增生李斯特菌感染模型的初步研究

研究单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,简称Lm)对棉铃虫(Helicoverpa armigera)的致病性,探讨棉铃虫作为Lm感染模型的可行性。用野生株EGDe(中毒)、PrfA缺失株(EGDeΔprfA,弱毒)和PrfA组成型高表达株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA~*,高毒)腹腔微量注射4龄棉铃虫幼虫,计算半数致死量(LD_(50))和虫体的载菌量,同时观测棉铃虫中肠细胞的病理变化以及血细胞包囊作用和数目。实验结果显示:①EGDe、EGDeΔprfA和EGDeΔprfA+pERL3-prfA~*的LD_(50)分别为2.56×10~3 cfu/mL、1.98×10~6 cfu/mL和6.63×10~2 cfu/mL。②感染Lm后,EGDe和EGDeΔprfA+pERL3-prfA~*在棉铃虫体内各部分的活菌数均有所上升,而EGDeΔprfA却显著下降。③中肠病理切片显示,Lm对棉铃虫幼虫中肠细胞的损伤程度与菌株的毒性高低正相关,并且随时间延长差异更为明显。④EGDeΔprfA+pERL3-prfA~*对棉铃虫血细胞的包囊作用的抑制作用最强,而EGDeΔprfA基本无抑制作用。⑤感染Lm后,棉铃虫的血细胞数量先急剧上升随后减少。72 h时,感染EGDe、EGDeΔprfA和EGDeΔprfA+pERL3-prfA~*的血细胞减少量分别为45%、27%和71%。结果表明,Lm不仅能成功侵染棉铃虫幼虫并致其死亡,且其半数致死量、其对棉铃虫中肠细胞的损伤程度以及对血细胞包囊作用和数量的影响等均与细菌毒力高低有较好的关联性,表明棉铃虫幼虫(至少是4龄棉铃虫幼虫)适合作为研究Lm致病机制的昆虫模型。