用Red/ET重组酶构建基因打靶载体

基因敲除的小鼠模型是研究基因功能的一种重要资源。采用常规分子克隆的方法建立基因敲除的打靶载体存在构建效率低和难以获得长片段同源臂的缺点。因此快速高效地构建打靶载体,已成为获得特定基因敲除动物模型的关键环节。为研究Resp18未知功能分泌肽基因,应用一种新的DNA工程平台——Red/ET同源重组技术来构建其打靶载体,并比较了这一方法在构建不同长度同源臂中的效率。研究表明,Red/ET重组方法构建打靶载体具有很高的效率,可以获得较长的同源臂,并且不会引入突变,有助于获得更高的打靶效率。因此Red/ET重组为构建打靶载体提供了一种新的可靠的方法。     

白念珠菌MP65和SAP2蛋白原核表达质粒的构建与表达

目的构建以白念珠菌基因MP65和SAP2为目的基因的原核表达质粒,IPTG诱导其表达融合蛋白,并对其免疫原性进行分析。方法PCR法自白念珠菌标准菌株获取MP65和SAP2基因,分别插入至原核表达载体pGEx．4T之和pET32a中;将重组表达质粒转染感受态EcoliBL-21,经IPTG诱导表达、纯化后,SDS—PAGE和Western blot分析。结果PCR法克隆出全长为1140bp的MP65和1197bp的SAP2基因,构建的原核表达质粒pGEX-4T-2-MP65及pET32a-SAP2,可分别表达出66KD左右的GST融合蛋白和His融合蛋白。结论成功获取了白念珠菌基因^伊65和SAP2,所构建的原核表达质粒在BL-21中成功表达;两种蛋白均有免疫原性。     

条件性定点基因捕获载体的构建

基因捕获是依赖于捕获载体的随机插入产生突变而进行基因功能研究的一类重要技术。由于传统捕获载体在捕获位点上的局限性,各种新型的捕获载体正在不断地被设计并应用于基因捕获技术。以PL-451为基础质粒,结合定点的重组酶识别位点LoxP及Frt序列,突变LoxP的1个碱基的LoxP511A和LoxP511B,SA位点以及不含启动子但有poly(A)的EGFP片断,构建了能够在捕获元件两侧克隆同源臂的条件性基因捕获载体,从而为实现可调控性基因捕获奠定基础。