稳定高表达和干扰Nodal基因黑色素瘤细胞株构建及EMT表型鉴定

目的:构建稳定过表达及稳定干扰Nodal的黑色素瘤细胞B16细胞株,并鉴定其EMT表型,用于研究Nodal诱导黑色素瘤EMT的现象及机理。方法:将过表达小鼠Nodal基因的质粒pL-tdTomatomNodal,及携带有干扰Nodal基因序列的shRNA质粒pGFP-V-RS-Nodal,分别转染B16细胞。通过抗性筛选富集,阳性克隆挑选及扩大培养,获得稳定转染细胞株B16/dT-mNodal及B16/sh-Nodal。通过实时荧光定量PCR和Western blot技术检测胞内Nodal的过表达及敲除情况和EMT标记物的表达情况。结果:两株细胞均构建成功,B16/dT-mNodal细胞株发出强烈红色荧光,胞内Nodal水平上调明显,并呈现间质细胞特性;B16/sh-Nodal细胞株发出强烈绿色荧光,胞内Nodal水平下调明显,并呈现上皮细胞特性。结论:成功构建稳定过表达Nodal及稳定干扰Nodal的B16细胞株,并构建Nodal影响B16细胞EMT过程的模型,为研究Nodal在黑色素瘤EMT过程中的作用提供了重要的实验工具。     

人源TNFα的原核表达及活性测定

目的:利用SUMO标签构建人TNFα原核表达载体,通过表达及纯化获得重组蛋白,为深入研究和利用人TNFα奠定基础。方法:利用PCR技术,从质粒pET32a-hTNFα中扩增出人TNFα成熟肽编码序列,并在其上游添加SUMO标签,与原核表达载体pET28a连接,构建表达质粒pET28a-SUMO-hTNFα。在BL21(DE3)工程菌中表达融合蛋白,经Ni-NTA纯化体系纯化,切除SUMO标签,纯化获得hTNFα成熟蛋白。CCK-8法检测TNFα对L929细胞的细胞毒性,以测定TNFα的生物学活性。结果:成功构建pET28a-SUMO-hTNFα原核表达质粒,酶切鉴定和测序分析与预期结果完全一致。在BL21(DE3)工程菌中实现了融合蛋白的可溶性表达。经纯化、水解酶切除标签及再次纯化获得hTNFα成熟肽。CCK-8法检测得所制备的TNFα蛋白ED50约为12.8μg/ml。结论:成功构建原核表达载体pET28a-SUMO-hTNFα,经表达、纯化、酶切及再纯化,获得有生物活性的hTNFα蛋白,为深入研究和利用hTNFα奠定基础。