肠膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶的酶学表征及在催化合成α-熊果苷中的应用

将来源于肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides ATCC 12291的蔗糖磷酸化酶(Sucrose phosphorylase,SPase)基因进行密码子优化后将其插入到pET-28a中构建表达载体pET-28a-spase,诱导大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET-28a-spase表达制得SPase粗酶液,将重组SPase纯化后进行酶学表征。结果表明,重组SPase的比酶活为213.98 U/mg,纯化倍数为1.47倍,酶活回收率达87.80%。该酶最适温度为45℃,最适pH为6.5,该酶对蔗糖的Km为128.8 mmol/L,Vmax为2.167μmol/(mL·min),kcat为39 237.86 min-1,利用重组SPase催化氢醌合成α-熊果苷,最优条件为:氢醌添加量为40 g/L,蔗糖/氢醌的摩尔比为5:1,重组SPase 250 U/mL。在25 mmol/L的吗啉乙磺酸(MES)缓冲液(pH 7.0)中,反应温度30℃,避光反应24 h后终止反应,再用500 U/mL的糖化酶40℃处理2.5 h。α-熊果苷产量达98 g/L,氢醌的转化率接近99%。综上所述,文中克隆并研究了重组SPase,并建立了其在α-熊果苷生产中的应用。     

酸性木聚糖酶的研究进展

综述了酸性木聚糖酶的产生、纯化和性质、结构基础及应用。发酵底物和pH对酸性木聚糖酶的产生影响很大。酸性木聚糖酶在pH4．0以下是稳定的,在酿酒工业和饲料工业有潜在的广泛用途。     

“微生物学”一流课程教学改革与实践

“微生物学”课程是酿酒工程、生物工程、生物技术等专业的必修课程,也是一门重要的专业核心课程。基于培养具有科学探究能力的创新型人才的教学目标,我们教学团队深入改革“微生物学”课程,建设一流本科课程。通过贯彻“以学生为中心”和“科研反哺教学”的教学理念,深入挖掘课程育人价值,开展课程思政建设工作,建设慕课(massive open online course, MOOC)平台“微生物学”课程线上教学全套资源,构建“夯实基础-解构问题分析训练-研讨课”的教学模式,改进学生学习模式,改革学习过程评价体系,以及指导学生参加科创竞赛等教学改革实践,全面提高学生的科学探究能力,为社会储备具有科学探究能力的创新型人才,为工科院校建设一流课程提供借鉴。     

代谢工程改造热带假丝酵母生产1,2,4-丁三醇

【背景】 1,2,4-丁三醇属于手性多羟基醇,是一种重要的有机合成的化学中间体,以木糖为原料经四步酶反应是目前研究最多的生物合成路线。然而大肠杆菌的鲁棒性较弱,对发酵液中一些抑制剂的耐受性不是很好,同时存在严重的碳代谢抑制。近年来,鲁棒性较好的酵母菌成为更有吸引力的宿主,其中热带假丝酵母具有天然的木糖代谢途径,可以更好地利用木糖。【目的】在热带假丝酵母中构建从木糖到1,2,4-丁三醇的代谢途径。【方法】在热带假丝酵母中敲除木糖还原酶基因GRE3,从而阻断自身的木糖代谢途径。将来源于Caulobacter crescentus的木糖脱氢酶基因(xylB)和木糖酸脱水酶基因(xylD)及来源于Lactococcus lactis的酮酸脱羧酶基因(kdcA)克隆至C. tropicalis 207中,得到重组菌C. tropicalis BT,在此基础上考察重组菌代谢木糖合成1,2,4-丁三醇的能力,确定限速步骤,并通过增加关键基因xylD与kdcA的拷贝数提高1,2,4-丁三醇产量。【结果】在30℃、200 r/min、接种量1%、以30 g/L木糖为底物的情况下,重组菌的1,2,4-丁三醇的产量达到了1.2 g/L,在5 L发酵罐中的产量达到了3.7 g/L。【结论】在热带假丝酵母中实现以木糖为底物的1,2,4-丁三醇代谢途径,并通过在基因组上增加关键基因xylD与kdcA的拷贝数,获得了一株高产1,2,4-丁三醇的重组酵母菌株,这为后续在热带假丝酵母中进一步提高1,2,4-丁三醇产量奠定了基础。     

代谢工程改造热带假丝酵母高效合成中链ω-羟基脂肪酸

[目的]ω-羟基脂肪酸(ω-hydroxyfatty acid,ω-HFAs)是一种绿色安全无毒,具有良好生物相容性的理想生物降解材料,广泛应用于化工、食品、药学等方面,微生物发酵法生产ω-羟基脂肪酸具有重要的研究意义和应用前景.[方法]为了得到高产ω-羟基脂肪酸的代谢工程菌株,通过同源重组技术,连续敲除二倍体热带假丝...     

产甘油假丝酵母甘油代谢关键酶的研究

本文对产甘油假丝酵母的甘油代谢关键酶进行了研究,发现产甘油假丝酵母同化甘油能力极弱,少量葡萄糖明显改善其同化甘油的能力;线粒体3磷酸甘油脱氢酶受3磷酸甘油的强烈诱导,受葡萄糖代谢的阻遏。在甘油发酵过程中,产甘油假丝酵母胞浆3磷酸甘油脱氢酶酶活处于较高水平并在36h和60h时出现两次酶活高峰,其中第一次酶活峰值水平决定产甘油假丝酵母的甘油合成和积累水平,成为甘油高速积累期(18～48h)甘油合成的关键性的限速酶。在甘油发酵18～48h内,3磷酸甘油酯酶的酶活处于高水平,并在36h时出现酶活峰值;处于缓慢甘油积累阶段的48～72h间,3磷酸甘油酯酶已处于低水平表达,此时,3磷酸甘油酯酶则成为甘油合成的限速酶。产甘油假丝酵母稳定并高表达其胞浆3磷酸甘油脱氢酶基因并且其所表达的3磷酸甘油酯酶酶活远高于胞浆3磷酸甘油脱氢酶这一特征是其高产甘油根本所在。     

运用定点突变提高重组木聚糖酶在毕赤氏酵母中的表达

运用PCR介导的定点突变对米曲霉(Aspergillus　oryzae)来源的木聚糖酶在毕赤酵母中的重组表达进行了研究,获得一表达量远远高于亲本的突变株I156A,对其进行了提纯并研究其酶学特性,除热稳定性外其余与亲本基本一致。突变株I156A所产木聚糖酶XynFl的分子量为35kD,在pH 4～9范围内稳定,最适pH为70,最适温度为45℃,在50℃以下稳定性略高于亲本。     

代谢工程改造酿酒酵母合成柠檬烯及其衍生物

柠檬烯及其衍生物紫苏酸作为重要的生物活性天然产物，广泛应用于食品、化妆品、保健品和医药等行业。然而，低效率的植物提取与高能耗的化工合成限制了柠檬烯和紫苏酸的工业合成。本研究在酿酒酵母中通过过氧化物酶体区室化表达绿薄荷来源的柠檬烯合酶，构建获得重组菌株，柠檬烯产量为0.038 mg/L。采用模块化工程分步表达参与柠檬烯合成的基因ERG10、ERG13、tHMGR、ERG12、ERG8、IDI1、MVD1、ERG20ww以及tLS，以研究其对柠檬烯产量的影响。通过增加前体模块，柠檬烯产量增加至1.14 mg/L。采用高拷贝数的质粒表达上述关键基因，柠檬烯的产量显著提高，达到86.74 mg/L，提高至初始菌株产量的4 337倍。以构建的柠檬烯生产菌株为出发菌株，通过表达丹参来源的细胞色素P450酶基因，实现了紫苏酸的生成，其产量达4.42 mg/L，为利用酿酒酵母构建高产单萜类天然产物的细胞工厂奠定了基础。