利用RNAi技术大规模分析基因功能的研究

将双链RNA导入细胞内会干扰与之同源的基因的表达 ,使生物体产生相应的功能缺陷表型 ,这种作用称为RNAi(RNAinterference)。针对人类、植物、微生物等大规模基因组测序后所面临的功能鉴定难题 ,着重探讨了RNAi的机制及其研究进展。复合物RISC和酶Dicer的发现揭示了RNAi导致同源基因沉默的作用机理。通过使用RNAi这种反向遗传学工具可使生物体产生相应的功能缺陷表型 ,从而确定未知基因的功能。因此RNAi对大规模分析动、植物基因功能的研究具有重要的作用。     

红纹黄单胞菌a-氨基酸酯水解酶的克隆、序列分析及热稳定性提高

【目的】克隆红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶基因全序列,对序列进行生物信息学分析,并提高酶的热稳定性。【方法】利用多聚酶链式反应(PCR)克隆α-氨基酸酯水解酶基因全序列;应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过同源建模,预测红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的三维结构;通过定点突变替换氨基酸序列中高度柔性的位点,提高该酶的热稳定性。【结果】从红纹黄单胞菌(Xanthomonas rubrillineans)中扩增得到α-氨基酸酯水解酶基因aeh(GenBank登录号JF744990),核苷酸序列长度1 917 bp,编码638个氨基酸。序列比对和同源性分析显示,该酶与白纹黄单胞菌Xanthomonas albilineans str.GPE PC73的肽酶及地毯草黄单胞菌Xanthomonas axono-podis pv. citri str. 306的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶氨基酸序列相似性最高,分别为91%和83%,系统进化分析表明,该酶与白纹黄单胞菌Xanthomonas albilineans str. GPEPC73的肽酶亲缘性最高。基于预测的三维模型,对高度柔性的位点进行饱和突变,从282株突变体中筛选得到3株T50较野生型高5°C以上的突变体。【结论】对红纹黄单胞菌AEH的氨基酸序列分析有助于探索同源蛋白的进化过程。对高度柔性位点进行饱和突变的策略可以用于提高热稳定性。     

盐生杜氏藻(Dunaliella salina)cDNA文库构建及功能基因筛选

采用Qiagen公司的植物总RNA提取技术、Clontech公司的CreatorTM技术平台以及SMARTTM技术进行cDNA文库构建.从杜氏藻中提取出了高质量的总RNA,通过PowerScript反转录酶反转录杜氏藻的总RNA,采用LD-PCR、酶处理等方法对cDNA进行等比例扩增、纯化,同时使用CHROMA SPIN-400柱子将cDNA分段化,最后将长片段连入pDNR-LIB质粒,1.5 kV,25 μ F电转化大肠杆菌JM109,得到含1.5×106个克隆子的原始文库,滴度为1.5×106cfu ml-1.结合酶切和PCR,对该文库的质量进行了鉴定和统计,文库的平均片段插入长度为1.5kb.采用烯醇酶和UDP葡萄糖脱氢酶的EST作为同源探针,对文库中的功能基因进行筛选,并采用放射性原位杂交法,对扩增文库进行了初筛和复筛,得到了含这两条基因全编码序列的cDNA,烯醇酶为1.8kb,UDP葡萄糖脱氢酶为1.9kb,为今后对该种进行大规模功能基因组学研究奠定基础.     

利用RNAi技术大规模分析基因功能的研究

将双链RNA导入细胞内会干扰与之同源的基因的表达,使生物体产生相应的功能缺陷表型,这种作用称为RNAi（RNA interference）。针对人类、植物、微生物等大规模基因组测序后所面临的功能鉴定难题,着重探讨了RNAi的机制及其研究进展。复合物RISC和酶Dicer的发现揭示了RNAi导致同源基因沉默的作用机理。通过使用RNAi这种反向遗传学工具可使生物体产生相应的功能缺陷表型,从而确定未知基因的功能。因此RNAi对大规模分析动、植物基因功能的研究具有重要的作用。     

耐高温、耐酸产酒精酵母的筛选与鉴定

以白酒厂窖泥和生产用酒曲为材料,富集、分离得到32株酵母菌,从中筛选到1株产乙醇能力强,耐高温、耐强酸、起酵速度快的菌株Y30。该菌株能在45℃正常发酵,且致死温度达到59℃,比文献中报道高5℃;能在pH2．5的条件下正常发酵;能耐14％的酒精度;起酵速度快,接种4h后即开始发酵。对菌株进行形态分析、生理生化实验、Biolog鉴定和分子鉴定,确定该菌株为Saccharomyces cerevisia。该菌株的成功选育为后续高效生产乙醇提高了很好的菌种来源。     

酶切菌紫质C端引起的紫膜蛋白的发光性质变化

用木瓜蛋白酶切去bRC端尾巴约20—25个氨基酸之后发现:在KCl盐浓度作用下,其蛋白荧光光谱中的色氨酸荧光成份有明显的增强;用Cs~ 对bR蛋白荧光的猝灭实验表明此色氨酸荧光成份的增加是由于在KCl作用下bR中某些色氨酸残基暴露的结果;磷光光谱实验表明在KCl作用下色氨酸磷光的增加也是由于色氨酸残基暴露的结果。本文讨论了这种构象变化可能影响正常bR分子中菌蛋白光循环的进行,从而使质子泵效率降低;并且此构象变化可能与其C端尾巴的构象有关。     

酶切菌紫质(bR)C端对紫膜光循环和质子泵效率的影响

本文研究紫膜悬浮液经低剂量木瓜蛋酶处理去掉菌紫质(Bacteriorhodopsin简写bR)分子C-末端后。其光循环产物和质子泵效率的变化。实验发现经酶切后,M_(412)产物中慢衰减组份M_(412)降低了20％,O_(640)降低了50％,而质子泵效率降低了70％。双光脉冲实验表明酶解作用并不影响光循环周期。这些事实说明了去C-端所引起的质子泵效率降低,不是通过光循环的途径而产生的。介质中离子强度对正常紫膜和酶解紫膜的质子泵效率有明显不同的影响 说明了C端在不同盐浓度中的构象对质子泵行为有很重要的作用。     

全细胞高通量筛选α-氨基酸酯水解酶突变体的方法

【目的】建立高效敏感的高通量筛选方法,用于筛选头孢克洛合成活性提高或热稳定性提高的α-氨基酸酯水解酶。【方法】根据头孢克洛在碱性条件下水解生成的衍生物在340 nm处有特征吸收峰的原理,制作出标准曲线。采用全细胞96孔板紫外分光光度法高通量测定α-氨基酸酯水解酶突变体的头孢克洛合成活性。【结果】头孢克洛含量与△A340?405在(0.1?0.6)×10?3 mol/L浓度范围内有良好的线性关系,服从朗伯-比尔定律,平均回收率为99.8%?101.3%。一轮定点饱和突变产生的2 300个克隆经该方法的筛选,获得3株kcat提高40%以上,4株半失活温度较野生型提高5°C以上的突变体酶。【结论】该方法准确可靠,每天筛选量可达到2 000个反应,达到高通量筛选的要求。     

全细胞高通量筛选a-氨基酸酯水解酶突变体的方法

【目的】建立高效敏感的高通量筛选方法,用于筛选头孢克洛合成活性提高或热稳定性提高的a-氨基酸酯水解酶。【方法】根据头孢克洛在碱性条件下水解生成的衍生物在340 nm处有特征吸收峰的原理,制作出标准曲线。采用全细胞96孔板紫外分光光度法高通量测定a-氨基酸酯水解酶突变体的头孢克洛合成活性。【结果】头孢克洛含量与△A340?405在0.1?0.6×10?3 mol/L浓度范围内有良好的线性关系, 服从朗伯-比尔定律, 平均回收率为99.8%?101.3％。一轮定点饱和突变产生的2 300个克隆经该方法的筛选, 获得3株kcat提高40%以上, 4株半失活温度较野生型提高5 °C以上的突变体酶。【结论】该方法准确可靠,每天筛选量可达到2 000个反应, 达到高通量筛选要求。     

猕猴结肠镜下活检组织病理学观察

目的通过对猕猴结肠镜检及活检取材,对结肠镜检测方法应用于非人灵长类动物予以评价。方法实验猴在麻醉状态下接受结肠镜检查和活检标本取材,对活检标本进行固定和病理切片观察,并对所检猴进行解剖和组织学观察,比较各取材点的情况。结果结肠镜下及大体标本观察见猕猴肠壁厚度明显小于人体,活检取材部位见黏膜破损、肠出血,个别部位见肠穿孔。病理切片HE染色观察发现,与人体比较,猕猴大肠腺较小而表浅,固有层内淋巴小结数量较少,肌层、黏膜下层明显较薄。结论对猕猴行结肠镜检查及镜下活检取材是可行的,但因猕猴肠壁较人体薄而极易穿孔,故需尽量应用活检杯小的活检钳,并需要充分的肠道准备和有经验的肠镜操作。