血卟啉单甲醚在A549肺癌细胞内亚细胞分布的动态变化

目的:探讨血卟啉单甲醚(Hematoporphyrin monomethyl ether,HMME)在A549肺癌细胞内亚细胞分布的动态变化。方法:传代培养A549肺癌细胞,分别与光敏剂HMME孵育2 h和12 h。应用由荧光显微镜及电感耦合器材(Charge-coupled device,CCD)组成的高分辨率荧光显微成像系统,结合荧光探针标记技术,采用细胞器-细胞荧光强度比值法研究HMME在不同时间的亚细胞分布情况。结果:在2 h和12 h两个孵育时间点高尔基体的平均荧光强度比值(J1/J2)值都最高;随着孵育时间延长,A549细胞的四种细胞器J1/J2值都升高且溶酶体幅度最大。结论:孵育时间是影响HMME亚细胞分布的一个重要因素。随着孵育时间的延长,A549肺癌细胞各细胞器吸收HMME能力逐渐增强,尤以溶酶体显著。     

荧光探针在光动力疗法亚细胞损伤位点研究中的应用

目的：应用荧光探针在光动力疗法研究中检测亚细胞损伤位点。方法：传代培养鼠肺毛细血管内皮细胞,将血卟啉单甲醚(HMME)与内皮细胞共同孵育24小时后,加入线粒体探针Bhodamine-123、内质网探针DioC6(3)和溶酶体探针Lucifer yellow分别对细胞器染色。首先采用激光共聚焦显微镜对光敏剂进行亚细胞定位。应用荧光显微镜汞灯照射激发光敏剂的光动力效应,加入ROS探针H2DCF-DA检测产生的单线态氧。分别在激发前后采集Pdloclamine-123、Lucifer yellow和DioC6(3)的荧光图像。结果：线粒体探针Phodamine-123的荧光图像在光动力损伤前后差异显著,原有形态特点发生明显改变;Phodamine-123在光动力损伤后再分布于细胞核区。结论：血卟啉单甲醚介导的光动力效应导致亚细胞水平多位点损伤,线粒体和核膜可能是PDT敏感位点;荧光探针标记检测光动力损伤亚细胞位点方法简便可靠。     

超高灵敏度荧光显微成像技术对光敏剂细胞内分布的初步研究

目的：探讨应用基于ICCD的超高灵敏度荧光显微成像系统研究光敏剂细胞内分布的可行性。方法：传代培养内皮细胞、食管癌细胞和肺癌细胞,将不同浓度血卟啉单甲醚(HMME)与细胞共同孵育不同时间。采用荧光显微镜及ICCD组成的荧光显微成像系统采集不同浓度及不同孵育时间条件下HMME的荧光图像,并采用计算机图像处理技术进行图像增强、滤波后计算其细胞浆与细胞核的平均荧光强度比值。同时应用激光共聚焦显微镜图像采集进行对比。结果：HMME浓度为5μg／ml时,荧光显微镜采集到HMME的荧光图像;HMME浓度升高到160μg／ml,激光共聚焦显微镜获得HMME的荧光图像。两组图像的特点都为胞浆中荧光强度较高,细胞核区荧光较弱;细胞浆与细胞核的比值约为2～3：1。结论：荧光显微镜和ICCD采集细胞内光敏剂的荧光图像灵敏度高,方法可靠、实用。HMME较多分布在细胞质中,细胞核吸收较少。     

三套荧光显微成像系统在光敏剂亚细胞定位研究中的应用比较

目的：对三套荧光显微成像系统在国产新型光敏剂HMME亚细胞定位研究中的应用特点及适用范围进行了比较与评价。方法：分别应用LSCM、CCD、ICCD荧光显微成像系统,选择特异性细胞器荧光探针Rhodamine-123、DIOC6(3)标记细胞内线粒体和内质网。采用细胞器-细胞荧光强度比值法,对HMME进行单细胞内分布的定性与定量研究。结果：LSCM和CCD成像系统能采集到浓度达到160μg／ml时的HMME的荧光图像,获得荧光探针图像信息显示所标记的细胞内线粒体和内质网平均荧光强度比值(J1/J2值)都明显高于细胞内J1/J2值。而ICCD成像系统只需HMME浓度为5μg/ml,荧光图像特点都呈胞浆中荧光强度较高且分布不均,细胞核区荧光较弱的中空现象。ICCD系统对细胞器探针荧光图像在空间分辨上不理想。结论：LSCM与CCD成像系统限于其探测灵敏度,对于弱荧光性光敏剂,适用于其高孵育浓度条件下的亚细胞定位研究。二者获得的结果相一致：孵育24h,HMME在鼠肺内皮细胞线粒体和内质网有分布而几乎不进入细胞核。ICCD成像系统可不受孵育浓度条件的限制,实现光敏剂极微弱荧光的有效探测,但空间分辨率较低。