滇金丝猴粪便微生物来源的β-半乳糖苷酶基因的表达及酶学性质

【目的】对滇金丝猴粪便微生物来源的β-半乳糖苷酶进行异源表达和纯化,并研究其酶学性质。【方法】从滇金丝猴粪便微生物的宏基因组中克隆出一个β-半乳糖苷酶基因galRBM20_1,对该基因进行异源表达和酶学性质分析。构建含有T7强启动子的pEASY-E2-galRBM20_1质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行酶学性质研究。【结果】滇金丝猴粪便来源的β-半乳糖苷酶(galRBM20_1)最适pH为5.0,在pH 4–7之间能保留70%及其以上的活性。最适温度为45°C,在37°C和45°C下耐受1 h,酶活不变。特别的是,该酶具有良好的Na Cl稳定性,经1–5 mol/L的Na Cl作用1 h后,相对酶活均能超过初始酶活:当NaCl的作用浓度为4 mol/L时,β-半乳糖苷酶相对酶活最高(146%);当NaCl的作用浓度为5mol/L时,β-半乳糖苷酶的相对酶活仍达到135%。【结论】本研究从滇金丝猴粪便微生物的宏基因库中克隆得到β-半乳糖苷酶基因galRBM20_1,并成功在大肠杆菌BL21(DE3)表达,首次从动物胃肠道宏基因组中获得具有耐盐和转糖基产Galactooligosaccharides(GOS)性能的β-半乳糖苷酶。该酶具有良好的耐盐性,和较广的pH作用范围,使其在食品、生物技术领域和环保方面的发展具有良好的应用价值。     

倭蜂猴粪便微生物苯酚羟化酶和邻苯二酚1,2-双加氧酶基因多样性研究

【目的】分析倭蜂猴粪便微生物中苯酚羟化酶(Phenol hydroxylase,PH)和邻苯二酚1,2-双加氧酶(Catechol 1,2-dioxygenase,C12O)的基因多样性。【方法】利用简并引物,以倭蜂猴粪便微生物宏基因组DNA为模板,通过PCR扩增,分别构建PH和C12O基因克隆文库,并对克隆进行测序分析。【结果】倭蜂猴粪便微生物来源的PH和C12O基因序列经BLAST比对分析,与GenBank中相应酶的序列一致性分别介于92%?100%和87%?100%。系统进化树分析表明PH基因序列与Neisseria、Burkholderia、Alcaligenes、Acinetobacter 4个属来源的PH序列相关;C12O基因序列全部与Acinetobacter来源的C12O序列相关。序列比对结果表明PH序列具有LmPH (Largest subunit of multicomponent PH)中高保守的两个DEXRH结构域;C12O序列具有能被Ag+和Hg2+抑制的位点(半胱氨酸)。【结论】倭蜂猴粪便微生物来源的PH为多组分PH,其降解苯酚的中间产物邻苯二酚可以被C12O通过邻位开环途径裂解。     

粪便微生物宏基因组来源的热稳定性邻苯二酚1,2-双加氧酶异源表达及酶学性质

【目的】克隆倭蜂猴粪便微生物宏基因组的邻苯二酚1,2-双加氧酶基因cat PLCgl,并对该酶进行异源表达及酶学特性研究。【方法】利用宏基因组高通量测序技术获得cat PLCgl,并对其氨基酸序列进行分析。将cat PLCgl重组到载体p EASY-E2中并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,研究其酶学性质。【结果】cat PLCgl全长852 bp,G+C含量48%,编码283个氨基酸,理论分子量为33.56 k D。重组Cat PLCgl酶学性质分析显示最适作用p H为7.0,其中在p H 7.0–10.0范围内处理1 h后,酶活剩余90%以上;最适作用温度为40°C,在25°C和40°C条件下稳定性较好,耐受210 h酶活性几乎不变。重组酶在最适条件下的动力学参数K_m、V_(max)和k_(cat)分别为24.9μmol/L、8.3 mmol/(min·g)和13.7 s~(-1);Fe~(2+)、Hg~(2+)、Cu~(2+)、Triton X-100、SDS、Ag+强烈抑制该酶活性,而其它金属离子及有机试剂影响较小。【结论】从倭蜂猴粪便微生物宏基因组中克隆得到邻苯二酚1,2-双加氧酶基因cat PLCgl,并对重组Cat PLCgl酶学性质进行研究,该酶具有较好的热稳定性和耐碱性,在降解环境中的邻苯二酚和生产顺,顺-己二烯二酸方面具有应用潜力。     

植酸酶固体发酵条件的研究

黑曲霉Ｇ２.１．１．１．４菌株在产生植酸酶时受无机磷的反馈阻遏,并且植酸酶的产生与淀粉酶的产生存在相互抑制。对植酸酶固体发酵进行调控和通过响应面分析优化发酵条件,提高了植酸酶产量。最适发酵条件下,植酸酶（ＰｈｙｔＡ）的产量可达６２．１ｕ／ｇ．干基。     

双波长法测定二元混合体系中戊糖的含量

目的:针对单波长法在测定己糖和戊糖的混合体系中戊糖含量时出现较大的误差,提出了等吸收双波长法测定二元混合体系中戊糖的含量.方法:通过对己糖(葡萄糖)和戊糖(木糖)的不同含量(5-150μg/体系)与显色剂反应产物在不同波长(500,～700nm)条件下吸光曲线以及显色剂本身吸光曲线进行综合考虑,确定双波长,并对单双波长法测定同样样品的回收率进行了比较分析.结果:确定的测定波长为670nm,参比波长为580nm,双波长法建立的标准曲线方程为:Y=0.0056x-0.0123(y为两个波长下吸光度的差值,x为木糖的含量(μg)).R2=0.9995,线性范围为5-30μg/体系.单波长法对标样和试样的平均回收率分别为116%±15%和89%±13%;双波长法对标样和试样的平均回收率为104%±4%和95%±11%.结论:与单波长和一些其他方法相比,双波长法测定混合体系中戊糖含量较为简便易行且可以提高准确度.     

胃肠道微生物及其分子生态学技术研究进展

由于与人类健康和疾病密切相关,胃肠道微生物研究已成为当今的热点研究领域。目前研究的分子手段已经从单纯的分析微生物群落结构组成,发展到通过宏转录组学、宏蛋白组学和代谢组学等"组学"技术揭示胃肠道微生物群落的相应功能。本文结合我们的研究工作,综述了国内外胃肠道微生物及其分子生态学技术的研究进展。     

来源于芽孢杆菌HJ14耐热酯酶的克隆表达、酶学性质及降解邻苯二甲酸二乙酯研究北大核心CSCD

【目的】克隆芽孢杆菌HJ14的酯酶基因Est Z1并利用大肠杆菌表达得到相应的酯酶,分析重组酯酶的酶学性质和对邻苯二甲酸二乙酯(Diethyl phthalate,DEP)的降解。【方法】特异性扩增酯酶基因Est Z1并对其全长测序,分析其氨基酸序列。利用p EASY-E2表达系统将Est Z1转化到Escherichia coli BL21(DE3)中完成异源表达。根据组氨酸标签纯化Est Z1,研究其酶学性质并利用HPLC和LC/MS检测系统定性分析其对DEP的降解。【结果】Est Z1全长903 bp,编码300个氨基酸残基,蛋白分子量33.84 k Da。Est Z1氨基酸序列分析结果显示,与NCBI数据库收录的HSL-like家族酯酶相似度最高可达到98%。酶学性质分析结果显示,Est Z1可水解碳链长度较短的p-NP底物,最适底物为p-NPC4(p-NP butyrate)。Est Z1的最适p H和最适温度分别为9.0和50°C,并且在p H 7.0–9.5和40–70°C范围内保持50%以上的酶活,为耐热碱性酯酶。Est Z1对多数金属离子和化学试剂保有良好的抗性。Est Z1可将DEP水解生成相应的单酯和醇。【结论】本文报道了Bacillus sp.HJ14来源的酯酶基因并对其在大肠杆菌中表达获得的重组酶的酶学性质进行研究,Est Z1具有良好的碱性p H耐受性和热稳定性,能够部分降解DEP,本研究对邻苯二甲酸酯类的生物降解有一定的参考意义。     

宏基因组学在人和动物胃肠道微生物研究中的应用进展

人和动物胃肠道存在大量微生物群落,这些微生物是与宿主长期共同进化的结果,并且同宿主的健康和疾病密切相关,因此胃肠道微生物研究已成为当今的热点研究领域。宏基因组学技术在这一领域的应用,使我们不仅能够对胃肠道微生物群落结构及多样性进行分析,还能进一步深入了解其代谢功能,开发和利用潜在的微生物及其基因资源。文中结合我们的研究工作,综述了宏基因组学在人和动物胃肠道微生物研究中的应用,同时着重介绍宏基因组研究的生物信息学技术。     

阳宗海中紫色非硫光合细菌的生态研究

为得到高原深水湖泊中的微生物生态分布信息,运用统计学软件,在2002年对阳宗海中的紫色非硫光合细菌的数量进行了数学分析。影响湖泊中PNSB数量分布的主要因素是水平位点、深度和采水期,溶氧、温度、透明度、COD和叶绿素a含量等环境因子对PNSB数量也有影响。各环境因子如叶绿素a含量和透明度之间也有相关性,对其进行了分析并计算出环境因子之间关系的一元回归方程。