丝氨酸蛋白酶的重组表达

丝氨酸蛋白酶是蛋白酶家族中的一大家族 ,广泛分布于细菌、病毒、真菌、植物、动物中 ,并参与生命的各种反应。随着丝氨酸蛋白酶研究的深入 ,重组表达获得大量的目的蛋白酶已成为研究该类蛋白酶的一大基础技术。本文重点综述了丝氨酸蛋白酶在不同表达系统中重组表达的优缺点及最新进展。     

蚯蚓纤溶酶新基因PV242的克隆与表达

从我国特有的双胸蚓属（Lumbricus bimastus）蚯蚓体内提取到一种有纤维蛋白平板溶解活性的蛋白质,采用聚偏二氟乙烯膜(PVDF)微量测序法测得蛋白质的N端氨基酸序列,依此设计简并引物,通过RT-PCR获得其对应cDNA.该cDNA全长888 bp,1～726位核苷酸对应读码框架(ORF),编码含242个氨基酸的成熟肽.终止子（TAG）位于cDNA的727～729位,其余核苷酸序列为3′端非编码区.成熟肽命名为蚯蚓纤溶酶PV₂₄₂.蛋白质预测得知蛋白质等电点为4.33,含组氨酸(His44)及丝氨酸 (Ser191)两个活性位点;蛋白质由两个结构域组成,表面有活性裂隙;该蛋白质属丝氨酸蛋白酶超家族胰蛋白酶类.经国际基因库等多种查询比较未见PV₂₄₂基因的报道,为首次发现的新基因,在国际基因库的输入号为GenBank AF109648.随后构建了pTrxFUS-PV₂₄₂重组质粒,并在大肠杆菌GI724中获得融合蛋白TrxA/PV₂₄₂的可溶性表达,采用离子交换层析法纯化表达蛋白,融合蛋白有纤维平板溶解活性.     

蚓激酶的克隆及其对BHK细胞的作用

蚯蚓具有活血化瘀的功效 ,在我国作为中药 (地龙 )使用已经有上千年的历史 .近年来发现蚯蚓体内存在溶血栓成分 ,称为蚓激酶 (ｌｕｍｂｒｕｋｉｎａｓｅ)或蚯蚓纤溶酶 (ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｉｎｅａｒｔｈｗｏｒｍ) .自Ｎ .Ｎａｋａ ｊｉｍａ报道从蚯蚓中分离到蚓激酶以来[1] ,国内外已经有许多报道[2～ 6] ,主要侧重于天然提取物的生化研究 .本文通过ＲＴ ＰＣＲ从蚯蚓 (Ｌ .ｂｉｍａｓｔｕｓ)体内获得蚓激酶基因 ,进行表达并观察其对ＢＨＫ细胞的作用 .1　材料与方法1 1　材料正蚓科双胸蚓属蚯蚓 ;反转录试剂 ,质粒ｐｃ…