老年大鼠神经组织星形胶质细胞的分选培养与炎性特征分析*

目的: 建立优化的年轻与老年大鼠神经组织星形胶质细胞的分离纯化方法,比较年轻大鼠与老年大鼠星形胶质细胞的形态、功能差异,探讨老化后星形胶质细胞的功能改变及其在衰老过程中发挥的可能机制。方法: 采用50%-35%的percoll密度梯度离心法分选年轻(2月龄)和老年(20月龄)SD大鼠的大脑与脊髓星形胶质细胞;每组细胞设置3个复孔,培养72 h后,采用免疫荧光检测星形胶质细胞特异性标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP),观察不同年龄阶段星形胶质细胞的形态特征;qPCR检测衰老标志(p16、p21)的表达,β-半乳糖苷酶染色检测星形胶质细胞的衰老情况;qPCR检测促炎因子(IL-1β、TNF-α)与抗炎因子(IL-10)的表达水平。结果: 采用50%-35%的percoll梯度分选得到的星形胶质细胞的数量多、活性好、纯度高达95%以上,可用于后续实验。与年轻大鼠神经组织的星形胶质细胞相比,分选自老年大鼠神经组织的星形胶质细胞在细胞形态上偏向激活态,突起较少;星形胶质细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率升高,p16、p21表达也明显增多(P<0.01);老年大鼠神经组织的星形胶质细胞的促炎因子(IL-1β、TNF-α)表达升高(P<0.05),抗炎因子(IL-10)表达有所降低(P<0.05)。结论: 50%-35%的percoll梯度可以作为大鼠神经组织星形胶质细胞的分选纯化、原代培养的方法;随着年龄的增加,星形胶质细胞发生细胞老化,表现出促炎症表型,促进神经系统的炎性衰老,可能是神经系统老化及神经退行性疾病的机制之一。     

大鼠前扣带皮层多巴胺D1受体参与痛相关情绪调节的行为-电生理学观察

本研究旨在探索前扣带皮层(anterior cingulate cortex, ACC)的多巴胺D1受体参与痛情绪反应的调节作用。第一天大鼠适应环境并记录检测指标的基础值;第二天预先在ACC给予多巴胺D1受体拮抗剂SCH-23390或激动剂SKF-38393,然后大鼠左后足底注射完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant, CFA, 0.08 mL),与特定环境匹配后建立条件位置逃避(conditioned placeavoidance,CPA)反应;第三天同步观察大鼠在痛环境中的CPA反应与ACC脑区神经元的放电频率,随后进行旷场行为、机械痛行为和热缩足反射潜伏期(paw withdrawal latency, PWL)测试;在另外一组实验中,给予大鼠足底注射生理盐水(NS),ACC脑区预先给予多巴胺D1受体拮抗剂或激动剂,并进行上述同样的实验观察。结果显示：(1)相比于对照组,足底注射CFA的大鼠PWL与机械痛阈值明显降低(P <0.05);(2)注射CFA组的大鼠在“痛环境”和旷场中心的停留时间明显缩短(P <0.05);(3)预先在ACC注射...     

婴幼儿发育期全身麻醉药暴露对认知功能的影响及机制

随着医疗技术的进步,各类先进设备、检测手段不断增加,通过手术或其他有创方式救治的疾病谱不断增加。越来越多的婴幼儿需要接受全身麻醉药(全麻药)麻醉进行临床检查或治疗,而全麻药是否对仍处在发育期的婴幼儿脑结构和功能(如认知)产生影响是一个重要、复杂而又有争议的问题,因而受到神经生物学、麻醉学和儿科学等领域学者的高度关注。人群调查结果证实,发育期短期单次全麻药暴露对认知功能的影响较弱,多次全麻药暴露则会对认知功能造成损伤。基于动物的研究进一步揭示了发育期全麻药暴露的损伤机制。全麻药暴露的时间点较麻醉时长更关键,突触形成高峰期最易受全麻药损伤;在突触形成高峰期,全麻药暴露可诱导胞内钙超载、线粒体损伤、能量代谢失衡,损伤细胞功能;启动细胞凋亡,诱导过度自噬,导致细胞丢失;抑制突触相关蛋白的表达,突触形成受损,干扰突触传递过程及可塑性,影响神经环路和脑区功能活动。因此,细胞损伤、细胞丢失和神经环路功能受损构成发育期全麻药暴露损伤认知功能的重要机制。此外,有研究应用高通量组学技术对全麻药暴露引起的差异表达基因进行了初步筛选,为深入研究全麻药损伤的基因表达及调控机制提供了新思路。本文从整体行为学、神经元网络、细胞损伤、基因表达及调控和脑功能代谢等方面对发育期全麻药暴露影响认知功能及相关机制的研究进展进行综述,希望能为临床婴幼儿全麻方案的制定提供理论依据。     

利用全细胞膜片钳技术记录大鼠脑片NMDA电流的研究*

目的: 采用全细胞膜片钳技术记录大鼠脑片实验中NMDA电流,并介绍诱发NMDA电流的自制刺激电极制作方法。方法: 在大鼠目标脑区快速取材并获取活性良好的脑片,分别通过含受体激动剂NMDA的孵育液灌流和电刺激诱发NMDA电流两种方式进行膜片钳记录;利用针灸针自制刺激电极。结果: 通过记录到大鼠脑片神经元的EPSC和AP可判断神经元的状态,比较两种方法诱导的NMDA电流幅度,即直接灌流受体激动剂NMDA(282.0±24.3) pA和自制刺激电极诱发(261.4±40.1)pA,二者电流幅度无明显差异(P＞0.05,n=4);自制刺激电极与进口刺激电极诱发的NMDA电流幅度分别为(267.2±36.5)pA vs (239.2±41.0)pA,二者电流幅度无明显差异(P＞0.05,n=4),证明自制刺激电极成功。结论: 大鼠脑片实验中,通过直接灌流激动剂与电刺激两种方式均可诱导NMDA电流,自制刺激电极为在脑片上记录诱发电流提供了一种经济、可靠的实验手段,便于各实验室应用。     

利用膜片钳技术标记脑片神经元的方法

目的: 介绍一种利用膜片钳技术标记脑片神经元形态的方法。方法: 利用振动切片机切好实验目标部位的脑片,用含有Neurobiotin^TM Tracer的电极内液灌注玻璃微电极,并进行全细胞膜片钳记录;实验结束后将脑片先用4％多聚甲醛固定、漂洗,再用含有Streptavidin-Texas Red和Triton X-100的PB染色,2 h后即可用荧光显微镜观察着色的神经元。结果: 将细胞膜电压钳制在-70 mV,阶跃刺激后神经元表现为逐渐增大的膜电流。电流钳模式记录时,阶跃刺激使神经元去极化,达到阈电位后爆发动作电位。荧光显微镜下可看到胞体和主要突起清晰完整的神经元形态。结论: 本方法适用于在膜片钳实验后观察所记录的神经元的形态特征,操作方便,图像直观清晰。     

微丝电极阵列的参考电极内置与外置的对比研究*

目的: 通过对比内置和外置参考电极的微丝电极阵列在记录大鼠脑神经元放电过程中的优缺点,优化微丝电极阵列的制作与埋置,为多通道电生理实时记录系统提供更加实惠、优异的媒介工具。方法: 采用镍铬合金丝、电路板、电极引脚和地线(银线)制作16通道的微丝电极阵列,通过内置(参考电极与电极阵列并列排布)或外置(参考电极与地线分别焊接在电极一侧的两端)微丝电极阵列的参考电极,观察对比两种电极在记录大鼠ACC脑区神经元放电中的区别。实验大鼠分为内置组(8只)和外置组(9只),检测指标有信噪比(n=8)、放电幅度(n=380)和放电频率(n=54)。结果: 内置与外置参考电极的微丝电极阵列均可顺利记录出大鼠ACC脑区神经元的电信号;与外置组相比,内置组的神经元电信号具有信噪比高(P＜0.05)、背景信号幅度小、受噪音干扰小,和放电幅度大(P＜0.05)的优点;锋电位放电频率没有显著差异(P＞0.05)。结论: 在记录大鼠ACC脑区神经元电活动时,内置参考电极的微丝电极阵列记录到更高信噪比、更大放电幅度的电信号,为多通道电生理技术提供更加可靠的工具。     

老年大鼠脊髓小胶质细胞分选新方法及功能特征观察*

目的: 建立分离纯化老年大鼠小胶质细胞的改良方法,并初步观察老年大鼠脊髓小胶质细胞的生物学特性。方法: 以年轻SD大鼠(2月龄)为对照组,采用胰酶、胰酶替代物和机械网搓法等不同的制备方法,制备大鼠小胶质细胞的单细胞悬液,通过检测细胞纯度、存活率,观察细胞形态特征,分析细胞的炎性功能特征等,确定老年大鼠(20月龄)小胶质细胞的分离纯化方法,观察老年大鼠脊髓小胶质细胞功能特征。结果: 胰酶消化所得细胞的存活率低(年轻大鼠83%,老年大鼠60%);机械网搓法虽得到的存活率较高(95%),但是细胞获取率最低(年轻大鼠((0.207±0.020)×10⁶,老年大鼠(0.243±0.023)×10⁶);采用胰酶替代物解离、密度梯度离心方法分选出的老年大鼠脊髓小胶质细胞数量多、活性好、存活率高,细胞纯度可达85%以上,我们采用此方法分选纯化不同年龄大鼠脊髓小胶质细胞,与年轻大鼠相比,老年鼠脊髓组织量大,所需消化液多,但消化时间缩短;与年轻大鼠小胶质细胞相比,老年大鼠脊髓小胶质细胞其胞体较大较圆,突起少且粗短,形态上偏向于激活状态,老年大鼠小胶质细胞促炎因子IL-1β表达降低(P＜0.05),而抗炎因子IL-10(P＜0.01)表达升高。结论: 成功建立胰酶替代物解离结合密度梯度离心法从大鼠脊髓组织中分离纯化小胶质细胞,老年大鼠脊髓内小胶质细胞整体表现出抗炎表型。