腺苷酸激酶基因在大肠杆菌中的可溶性高表达

报道了鸡肌腺苷酸激酶基因的克隆和在温控启动子P_RP_L调控下在大肠杆菌中的可溶性高效表达.SDS-PAGE分析表明,鸡肌腺苷酸激酶的含量可占大肠杆菌细胞总蛋白含量的38％.利用Johnson等的干冰/乙醇-冰水浴反复冻融法,可将此重组蛋白进行富集,纯度可达85％以上.鸡肌腺苷酸激酶可与抗兔肌腺苷酸激酶单克隆抗体产生强的交叉反应.     

新载体pET-DB对带有His-tag的仓鼠二氢叶酸还原酶的高效表达与纯化

报道了带有His-tag的仓鼠二氢叶酸还原酶基因的克隆和在DB序列增强下T7启动子调控该基因在大肠杆菌中的可溶性高效表达,SDS-PAGE分析表明,带有His-tag的仓鼠二氢叶酸还原酶的含量可占大肠杆菌细胞总蛋白质含量的46%.该酶的纯化可用常规的金属络合树脂一步纯化至SDS-PAGE一条带,经凝血酶切去His-tag的仓鼠二氢叶酸还原酶与用等电聚焦法获得的无His-tag的酶有相同的酶活性.     

防尘螨药物的实验室药效测试方法

建立防螨药物的药效测试装置与操作方法很有必要。由于尘螨形体微小 ,给防螨药效测试的操作带来诸多困难 ,作者利用螨虫的生物习性及特点 ,建立了布块集螨法、成螨自动分离与净化法、标定计数法 ,布块浸水计数法以及螨虫的驱避和杀灭效果的测试装置与测试方法。结果表明 ,采用成螨自动分离与净化法获得的成螨比例为 ( 94 0± 1 7) %;采用标定计数的精度 (成螨数 刻度 )为 ( 2 0 4± 6 6)只。标定计数 1 0 0 0只螨的实际回收率平均为 ( 75 9± 1 4 6) %,与手工计数无显著性差别 (P >0 0 5 )。实践表明 ,此技术与方法操作简便 ,结果可靠 ,使测试的速度及效果有明显提高     

综述: 细胞穿透肽及其结构改造在siRNA传递中的应用

小RNA药物应用于临床的主要技术瓶颈在于如何高效、低毒地将小RNA分子传递到它发挥功能的场所．基于细胞穿透肽在小RNA透皮给药的临床应用中所取得的进展,本文系统评述了近年来细胞穿透肽在小RNA的体内、体外传递方面的研究动态,分析了细胞穿透肽的结构改造对肽/小RNA复合物转染进入细胞发挥功能的影响,展望了细胞穿透肽作为小RNA的体内药物传递载体的发展方向．     

去辅基天青蛋白两种天然构象共存的热力学证据 ———差热温度扫描和圆二色的研究

天然态蛋白质能否在溶液中存在多种构象是一个有争议的问题 . 在前报道中已经鉴定出绿脓杆菌去辅基天青蛋白突变体 M121L 可以多种构象共存 . 用差热扫描量热和圆二色性的方法研究了野生型去辅基天青蛋白的热变性 . 结果表明在 pH 从 4.0 到 9.0 的范围内存在着两个摩尔热容最大值 . 较低温度下的去折叠反应在所研究 pH 范围内均部分可逆,而较高温度下的去折叠反应均不可逆 . 蛋白质去折叠的热容变化双峰用可相互转化的两种构象共存模型进行拟合 . 较低温度下能够去折叠的构象在 pH 4.0 时占 64% ,在 pH 9.0 时占 55%. 监测热变性过程中圆二色谱在 219 nm 处的信号变化也可以观测到两个独立的去折叠变化 . 信号变化的比值与在相同条件下差热扫描法测得的两种构象摩尔比一致 . 上述结果进一步支持了前文提出的去辅基天青蛋白在溶液中至少存在着两种构象的设想 .     

Activation and conformational changes of adenylate kinase in urea solution

Ａｄｅｎｙｌａｔｅｋｉｎａｓｅ(ＥＣ2.7.4.3)ｃａｔａｌｙｚｅｓｔｈｅｉｎｔｅｒｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆａｄｅｎｉｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏ:ＡＤＰ+ＭｇＡＤＰＡＭＰ+ＭｇＡＴＰ.Ｉｔｉｓｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓａｎｄｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙａｂｕｎｄａｎｔｉｎｔｉｓｓｕｅｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｎｅｒｇｙｔｕｒｎｏｖｅｒ.Ｒａｂｂｉｔｍｕｓｃｌｅａｄｅｎｙｌａｔｅｋｉｎａｓｅｉｓａｍｏｎｏｍｅｒｅｎｚｙｍｅｗｉｔｈｔｗｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｏｍａｉｎｓｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆ194ａｍｉｎｏａ…     

非贴壁微球体培养法分离T-淋巴细胞瘤干细胞及鉴定

通过非贴壁微球体无血清培养法,体外构建并鉴定了T-淋巴细胞瘤干细胞。采用细胞球悬浮培养方法富集T-淋巴细胞肿瘤干细胞,利用抑制分化作用的抑制剂CHIR99021和PD173074(2i)进行肿瘤干细胞的筛选,采用RT-PCR法检测Sox2、Oct4、Nanog、Klf4、Bmi1、C-Myc干细胞特征基因的表达,进一步采用Western blot验证Oct4蛋白水平表达,流式细胞术分析CD34、CD44抗体表达情况,用PI检测细胞周期,用CFSE观察细胞增殖能力,并将富集的T-淋巴细胞肿瘤干细胞进行裸鼠异体移植实验。在细胞球悬浮培养法基础上,利用具有抑制分化作用的抑制剂CHIR99021和PD173074,成功富集出Hut-102干细胞球。经RT-PCR鉴定,Hut-102干细胞球的其干细胞特征基因Sox2、Oct4、Nanog、Klf4、Bmi1、C-Myc表达均显著性高于Hut-102细胞并且高表达Oct4蛋白;经流式细胞术分析CD34、CD44抗体表达,有74.20%的Hut-102干细胞球表现为CD34+,有90.82%的Hut-102干细胞球表现为CD44+,证明抑制分化药物应用于细胞球悬浮培养方法中,能够有效富集出具有CD34+CD44+表型特征的Hut-102干细胞球;用PI检测细胞周期,富集的Hut-102干细胞球中处于G1/G0期的细胞为64%,处于S期的细胞为30.56%,表明该细胞暂不增殖或处于休止状态;用CFSE检测到富集的Hut-102干细胞球分化增殖能力显著高于Hut-102细胞。在NON/SCID裸鼠中,分别移植Hut-102细胞球和Hut-102细胞,结果显示,前者检测到67.74%±5.32%的淋巴细胞表达Hut-102细胞特异性标记物(CD3),而后者的裸鼠中未检测到,说明Hut102细胞球在NON/SCID裸鼠体内表现了T-淋巴细胞肿瘤干细胞特点和移植能力。首次在传统的非黏连微球体无血清培养法中加入两种抑制剂(CHIR99021和PD173074),富集出大量的微球体,通过干细胞特征鉴定及裸鼠移植实验,证明Hut-102细胞球具有T-淋巴细胞肿瘤干细胞特性。     

His-tag的人胞浆磷脂酶A_2的C2结构域的表达、纯化及性质

带有His tag的人胞浆磷脂酶A2 的C2结构域高效表达 ,用内源荧光的变化测定了其稳定性和其与钙离子结合的结合常数 .结果表明 ,带有His tag的C2结构域仍可有效用于研究其折叠及其与钙离子的协同性结合 ,温度从 2 2℃升高到 35℃时 ,C2结构域和钙离子结合的协同性程度显著增强 .     

腺苷酸激酶的脲激活及构象变化

用紫外吸收、圆二色、ANS结合外源荧光和小角X 射线散射等方法研究了腺苷酸激酶 (AK)的脲变性去折叠过程 .实验发现 :低浓度脲对酶有激活作用 ,最大激活的脲浓度是 1mol/L ;伴随着激活 ,酶分子的二级结构发生了微小的变化 ,但此时观察不到其整体结构的明显变化 .对照分析AK的晶体结构和催化反应机制 ,激活作用被认为是低浓度脲增加了酶分子活性部位的柔性 .AK与ANS结合荧光与脲浓度关系的研究支持了上述推论     

临近闪烁分析技术在生命科学研究中的新进展

起源于放射免疫分析的临近闪烁分析法(scintillation proximity assay,SPA)是一种均相、灵敏、快速和简便的基于闪烁载体的分析平台.放射性标记分子和亲和标签分子的多样化和商业化,以及液闪计数器和液相操作等技术的发展,使得SPA操作具有无需分离、被测目标分子易于固定和检测的优势.SPA已成为高通量检测的重要方法,广范应用于筛选药物靶点及先导化合物筛选、药物作用机理研究,以及病毒、肿瘤标志物等抗原的高通量检测.本文在简要介绍SPA技术的原理及系统分析SPA操作中环境、条件对测试结果影响的基础上,比较全面地介绍了SPA技术在生物学研究中的应用,尤其是在膜蛋白和细胞水平上的应用进展,介绍了应用实例,归纳了国内研究人员开展相关技术应用与技术创新的制约因素,给出了未来的发展趋势.基于SPA的生物学应用技术创新必然提升我们对细胞体系生物学的全面理解.