利用 CRISPR/Cas9 系统定向编辑黑腹果蝇Osiris24基因

Osiris基因在几丁质沉积过程中表达,可能参与昆虫表皮的发育。本研究利用CRISPR/Cas9 基因编辑系统对Osiris24基因进行编辑,进而观察Osiris24突变体果蝇的性状并且检测Osiris24的表达特征。在Osiris24第1外显子设计2个sgRNA靶位点,插入到pCFD4敲除载体骨架中,同时构建酵母Gal4蛋白序列的供体(donor)载体,将2个载体同时注射到nos-Cas9胚胎中获得G0代转基因果蝇。结果显示,G0代基因编辑阳性率为92.8%,Osiris24纯合突变体在胚胎或1龄幼虫期致死,杂合突变体未观察到可见表型。将阳性G0代雄虫与UAS-GFP雌虫杂交,检测不同龄期和不同组织GFP信号表达情况。结果发现,Osiris24在不同龄期幼虫中均有表达,幼虫期主要在体壁、气管、前肠和后肠高表达,蛹期主要在体壁和翅上表达,推测其在果蝇发育中发挥重要作用,本研究为深入探究Osiris基因功能提供了研究模型。     

一种新型的昆虫标本标签卡

介绍了一种新型的昆虫标本标签卡,这种标签卡有5个优点:多个标签互不遮挡;标签上不会留下昆虫针的针孔;标签卡所占空间可调节;不同大小的标签可兼顾使用;成本低,易操作。     

转飞蝗羧酸酯酶基因果蝇品系的构建及其在有机磷农药代谢解毒中的作用

【目的】在活体水平验证飞蝗Locusta migratoria羧酸酯酶基因LmCesA1和LmCesA2是否参与有机磷杀虫剂的代谢解毒。【方法】采用Gal4/UAS系统,借助转基因技术,构建两个转基因黑腹果蝇Drosophila melanogaster品系,选取3品系Gal4(act-Gal4, tub-Gal4和c601-Gal4)果蝇作为母本分别与两种转基因果蝇(UAS-LmCesA1和UAS-LmCesA2)以及一种亲本对照果蝇(RB0006{y v; attP40, y+})进行杂交。对子一代转基因果蝇从DNA和RNA水平进行验证,筛选出成功构建的品系。采用生物测定方法检测转基因果蝇与Gal4果蝇杂交后代对马拉硫磷的抗性。【结果】转基因果蝇DNA水平鉴定结果显示,转基因果蝇tub>LmCesA1和tub>LmCesA2中分别扩增到目的基因LmCesA1和LmCesA2,而对照组果蝇tub>attP40中未扩增到目的基因。转基因果蝇RNA水平的检测结果显示,这两个基因在相应的杂交后代中均有表达,表明转基因果蝇构建成功。目的基因在转基因果蝇成虫不同组织中的表达结果表明,两个目的基因LmCesA1和LmCesA2分别在转基因果蝇c601>LmCesA1和c601>LmCesA2的肠道中高表达; LmCesA1在c601>LmCesA1果蝇肠道中的表达量分别是脑和表皮中的7.6和16.7倍, LmCesA2在c601>LmCesA2果蝇肠道中的表达量分别是脑和表皮中的5.4和10.9倍。杀虫剂生物测定结果显示,与对照组果蝇(c601>attP40)相比,超表达LmCesA2的果蝇(c601>LmCesA2)对马拉硫磷的抗性显著提高,抗性倍数为1.67。【结论】本研究的结论与我们前期采用RNAi结合杀虫剂生测的研究结论一致,即羧酸酯酶基因LmCesA2可能参与飞蝗对马拉硫磷的代谢解毒过程。     

器官的构造是如何形成的——以果蝇翅为例

在器官发育过程中,细胞是如何接收到指令,在特定的位置形成特定的细胞形貌,来组建一个正确的三维构造实现器官的功能,这是生物学中的最基本问题之一。在发育的早期,选择者基因通过赋予细胞以不同的亲和性把组织划分为若干个隔间区域。隔间边界细胞作为组织者通过分泌信号分子(器官成形素)来促进细胞的存活和增殖,控制细胞的分化和命运,以及确保正确的细胞形貌发生。器官成形素的空间时序性表达以及随后细胞对这些信号分子的反应是正确形成组织构造的关键环节。根据国际最新的研究进展,本文综述了构造形成的机制和主流假说,并以果蝇翅的发育为例,讨论了TGF-β家族器官成形素Dpp在翅发育中的作用机制。     

异位表达Dichaete对果蝇足部发育的影响及其作用机制

【目的】果蝇Dichaete基因是Sox家族B亚家族基因,其表达贯穿整个胚胎发育阶段,在个体发育过程中发挥重要作用。Dichaete在野生型果蝇幼虫足芽上也有微弱表达,然而其在足发育过程中的作用少有报道。本研究旨在研究异位表达Dichaete对果蝇足部形态构成的影响,探索相关的作用机制。【方法】黑腹果蝇Drosophila melanogaster en-Gal4品系雄性成虫与UAS-Dichaete转基因品系处女蝇杂交,驱动Dichaete异位表达,解剖子一代成虫足,在显微镜下观察异位表达的Dichaete对成虫足形态结构的影响;同时采用免疫组化技术检测异位表达Dichaete对果蝇足芽细胞凋亡和Distal-less(Dll)表达的影响。【结果】异位表达Dichaete导致黑腹果蝇成虫足末端结构缺陷,引起3龄幼虫足芽细胞凋亡增加,上调了Distal-less基因的表达,但对Wg和Dpp信号均无影响;抑制细胞凋亡也无法拯救该缺陷。【结论】异位表达Dichaete导致黑腹果蝇成虫足末端结构缺陷,Dichaete可能通过上调Distal-less基因影响足部发育。     

Gal80~(ts)与Gal4组合灵敏控制果蝇中UAS转基因的表达水平

【目的】Gal80~(ts)与Gal4组合驱动UAS转基因表达是黑腹果蝇Drosophila melanogaster研究中常用的转基因过表达遗传学工具,通过温度控制实现对UAS转基因表达的灵活开关。Gal80~(ts)是一种温度敏感型蛋白,低温下(18℃)与Gal4蛋白结合并抑制其转录活力,高温下(29℃)解除对Gal4的抑制,从而允许Gal4结合UAS位点,启动UAS转基因的表达。但是从18~29℃的开关只能强烈过表达UAS转基因,而不能灵活调控转基因的表达水平。本实验系统研究一系列温度下转基因的表达水平,从而实现该体系对转基因的表达水平的灵活控制。【方法】以果蝇翅芽这一常用器官组织为研究模型,以2种Gal4品系(dpp-Gal4和en-Gal4,分别由decapentaplgic和engrailed基因的启动子驱动)分别与tub-Gal80~(ts)(微管蛋白基因tubulin启动子驱动)基因重组后,再分别与UAS-wg(wingless)转基因品系杂交;在一系列温度(18,25,27.5,28,28.5和30℃)下进行子代幼虫培养,通过免疫组化染色揭示并量化分析转基因wg在3龄幼虫翅芽上的表达水平。【结果】18~25℃培养条件下,Gal80~(ts)与Gal4组合系统中的UAS转基因不能表达;30℃时培养,转基因强烈地过表达;在25~30℃区间内,随着温度升高,转基因表达水平逐渐上升。【结论】在25~30℃之间的温度调控可以实现对Gal80~(ts)与Gal4组合系统中的UAS转基因表达水平的调控。本研究结果对调控转基因表达程度有重要价值。     

灵活操控果蝇翅芽中wingless基因表达水平的策略

【目的】灵活操控靶基因的表达水平对于研究基因的功能十分重要。Gal4/UAS系统已被广泛应用于调控基因表达,可研究果蝇Drosophila等模式生物复杂的生物学问题。受采用载体的特性及插入位点的影响,Gal4或UAS转基因品系在构建好之后,其调控靶基因的能力基本是确定的。本研究旨在在现有Gal4/UAS系统的基础上,开发一种新的策略,实现在果蝇翅芽中灵活操控wingless(wg)基因的表达水平。【方法】用遗传学手段将黑腹果蝇Drosophila melanogaster品系的UAS-wg和UAS-wg-RNAi转基因重组到同一黑腹果蝇品系中。将该重组黑腹果蝇品系与dpp-Gal4黑腹果蝇品系杂交,同时驱动UAS-wg和UAS-wg-RNAi在果蝇幼虫翅芽中共表达。杂交子代幼虫分别放置在不同的温度(18, 25和30℃)下培养。将幼虫翅芽解剖并进行免疫组化染色,测量染色的荧光强度,分析翅芽中wg的表达水平。【结果】在低温(18℃)下,UAS-wg在基因表达调控中起主要作用,wg表现为超表达,但其超表达的效率可被UAS-wg-RNAi有效地削弱。相反,在高温(30℃)下,UAS-wg-RNAi起主导作用,wg的表达受到抑制。并且通过转换温度,可实现wg在翅芽发育的不同阶段在超表达和抑制之间相互转化,从而灵活地操控wg基因在翅芽中的表达水平。【结论】该方法可以灵活操控果蝇翅芽中wg基因的表达水平,对于调控转基因的表达有重要的意义。     

昆虫平衡棒的发育及功能

平衡棒(haltere)是双翅目昆虫后翅特化而成的结构,可在飞行中起重要作用。平衡棒基部的感受器可以检测到飞行中的惯性力,向运动神经元提供反馈,迅速地平衡身体并纠正航向。昆虫的平衡棒由成虫盘发育形成,其特化受HOX基因(Ultrabithorax, Ubx)调控。发育成熟的平衡棒由两层上皮细胞组成,末端球状结构内部充满高度空泡化的细胞,基部具有大量感器。平衡棒的运动由独立的肌肉控制,相对于同侧的翅反向移动,翅与平衡棒的协同运动对于昆虫起飞和维持平衡十分重要。近年来,平衡棒的导航原理越来越多地应用于仿生学研究中,基于果蝇平衡棒的结构和功能,研制出多种飞行器的导航设备。本文结合近年来相关领域的研究成果,就平衡棒的发育、形态结构、功能和仿生应用等方面的研究进展进行综述,为深入理解昆虫平衡棒的发育机制和生物学功能提供参考。     

果蝇翅芽特异表达Gal4的筛选及活力检测

筛选并鉴定在果蝇翅芽不同区域特异表达的Gal4,可为以果蝇翅为模型的相关研究提供更多的遗传工具。本研究对Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)未见详细报道的Gal4品系进行筛选，将其中12个候选Gal4品系的雄虫与UAS-GFP基因型的处女蝇分别杂交，检测Gal4在子代幼虫翅芽的表达位置。经筛选重点关注3个Gal4,并以翅芽特异隔间标记物为参照，精确表征Gal4在翅芽的表达部位。结果显示：c563a-Gal4在前隔间翅囊区边缘及部分铰链区表达；c804-Gal4在围绕翅囊的环形区域以及A/P边界的细胞条带处表达；GMR11F02-Gal4在整个翅囊区表达；利用G-TRACE技术对上述Gal4的细胞发育谱系进行追踪，进一步揭示了翅芽发育历程中开启Gal4表达细胞的子代细胞分布区域；同时，通过驱动特定靶基因myc的表达，检测Gal4激活靶基因表达的活力。结果表明，3种Gal4都可以有效激活靶基因myc。其中，GMR11F02-Gal4的活力最强，c563a-Gal4最弱。本研究为翅芽相关研究提供新的遗传工具选项。