重组大肠杆菌全细胞催化L-苏氨酸合成2,5-二甲基吡嗪

2,5-二甲基吡嗪 (2,5-dimethylpyrazine,2,5-DMP) 在食品香料与医药方面具有重要的经济价值,工业上普遍采用环境不友好且反应条件苛刻的化学合成法来生产。文中结合代谢工程和辅因子工程策略设计高效催化L-苏氨酸合成2,5-DMP的全细胞催化剂,实现微生物转化法合成2,5-DMP。本研究首先分析了不同微生物来源的苏氨酸脱氢酶 (Threonine dehydrogenase,TDH) 对2,5-DMP合成的影响,发现来源于大肠杆菌Escherichia coli中EcTDH具有最佳的催化能力,2,5-DMP产量达到 (438.3±23.7) mg/L。随后结合辅因子工程,通过引入乳脂链球菌Lactococcus cremoris中NADH氧化酶 (NADH oxidase,LcNoxE) 并优化其表达方式发现通过融合表达EcTDH和LcNoxE可平衡胞内NADH/NAD+水平,维持较高细胞存活率,进一步提高2,5-DMP产量。最后,通过阻断合成2,5-DMP的支路代谢途径,可以显著减少副产物积累,增加2,5-DMP产量,同时提高L-苏氨酸转化率。最终获得的重组菌EcΔkΔAΔBΔA/TDHEcNoxELc-PSstT在含有5 g/L L-苏氨酸的转化体系中于37 ℃、200 r/min孵化24 h,可积累 (1 095.7±81.3) mg/L的2,5-DMP,L-苏氨酸转化率达到76%,产物得率为0.288 g/(g L-苏氨酸)。因此,文中构建的重组菌可以实现高效催化L-苏氨酸合成2,5-DMP,具有一定的工业应用潜力。     

NADPH缺陷型Corynebacterium glutamicum重组菌株的构建及其性能分析

[目的]改造谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中NADPH合成途径,阻断胞内NADPH的合成,获得1株NADPH营养缺陷型菌株。[方法]通过失活L-赖氨酸高产菌C. glutamicum Lys-χ中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Zwf)和苹果酸酶(MalE)并将NADP~+依赖型异柠檬酸脱氢酶(NADP~+-Icdcg)替换成变形链球菌(Streptococcus mutans)中的NAD~+-Icdsm,阻断胞内NADPH的合成。随后结合辅因子工程,引入大肠杆菌(Escherichia coli)中膜结合吡啶核苷酸转氢酶(PntAB)并通过不同强度启动子控制PntAB的表达水平。最后,分析不同重组菌中胞内氧化还原水平和L-赖氨酸生产强度的变化。[结果]重组菌C.glutamicum Lys-χΔZMI_(Cg)::I_(Sm)(即Lys-x1)胞内检测不到NADPH,为1株NADPH营养缺陷型菌株。该重组菌只在以葡萄糖酸为碳源的基础培养基中生长和积累L-赖氨酸,而以葡萄糖、丙酮酸、α-酮戊二酸和草酰乙酸为碳源时无法生长。此外,表达E.coli中的PntAB可回补重组菌Lys-χ1胞内NADPH的水平,但由于不同强度启动子控制PntAB表达水平不同,重组菌胞内NADPH水平也不同,并影响L-赖氨酸的生产强度。[结论]重组菌Lys-χ1可作为有效的底盘细胞,用于考察不同的NADPH再生策略,获得不同胞内NADPH水平的重组菌株,为进一步阐明NADPH调控微生物细胞生理代谢功能的机制提供研究基础。     

响应面法优化维生素K_2(MK-7)发酵条件

对实验室保藏的一株维生素K2(MK-7)高产菌的摇瓶发酵条件进行优化,结果表明菌体在静置培养状态下比在摇瓶培养状态下能够合成更多的维生素K2;同时发现玉米粉经过高温淀粉酶液化之后非常适合作为合成维生素K2的碳源。最后利用响应面法对发酵培养基中主要因素的最适宜水平及其交互作用进行了研究与探讨,优化后维生素K2产量由7.09 mg·L-1提高到了67.22mg·L-1,高于文献报道值。     

L-组氨酸产生菌的选育及发酵条件的优化

以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CLW0506（TRA^RDCP^R AMT^R histidine^- shikimic acid^-）为出发菌株,利用亚硝基胍（NTG）诱变选育得到缺失腺嘌呤脱氨酶、肌苷酸合成酶、肌苷酸脱氢酶活性的突变株CLW0125,使磷酸核糖焦磷酸（PRPP）到组氨酸的转化率大幅度提高。该菌株在以葡萄糖为碳源、硫酸铵为氮源的培养基中直接发酵72h,积累L-组氨酸可达9．2g/L。与亲株相比,L-组氨酸的产量提高了73．3％。研究了各单因素对发酵的影响。最后用响应面分析法得出最佳培养基配方。     

葡萄糖酸钙对L-组氨酸发酵的影响及条件优化

目的：提高L-组氨酸的产量并且得出最佳发酵条件。方法：在L-组氨酸的摇瓶发酵实验中,加入20g/L的葡萄糖酸钙,对发酵条件进行优化。结果：L-组氨酸的产量大幅度提高,产酸量由3.00g/L提高到7.50g/L。条件优化后L-组氨酸的产量提高到9.30g/L。结论：发酵培养基中20g/L的葡萄糖酸钙的加入能够诱导葡萄糖酸激酶生成,大幅度提高其比活,增大磷酸戊糖（HMP）途径的通量。有利于L-组氨酸的合成、菌体的生长。     

利用Design-Expert软件优化丝氨酸羟甲基转移酶产酶培养基

利用Design-Expert软件中水平设计和响应面分析法对产酶基本培养基主要成分进行了优化,经过逐步回归分析建立了丝氨酸羟叫基转移酶（SHMT）活力对培养基主要成分的二次回归模型,其回归方程的决定系数达到了0．9984。得到的最佳培养琏主要组成为：葡萄糖29．5g／L、硫酸铵18．1g/L、玉米浆3．79g／L。SHMT活力最高达到113．7U／ml,比优化前（77U／mL）提高了47．7%。优化后的酶液经酶促反应50h,能催化产生10g／L的L-丝氨酸,比优化前（6g／L）提高66．7％。     

L-精氨酸生物合成的代谢流量分析

建立并完善了谷氨酸棒杆菌GWY020及其2个逐步叠加不同遗传标记的突变株HUI821和GUI089合成L-精氨酸的中心代谢网络。分别测定了它们在特定培养时段(50 h~52 h)L-精氨酸等代谢物的胞外浓度, 由此计算这一时段这些代谢物在发酵液中积累(或消耗)的速率, 分别作出这3株菌在拟稳态下的代谢流量分布图, 进而研究育种过程中不同遗传标记的叠加对代谢网络中L-精氨酸合成流量分布的影响。结果表明遗传标记的引入使流量分配发生了重大变化, 节点处的流量分配朝着有利于L-精氨酸合成的方向改变。从代谢流量分析角度上, 证明结构类似物抗性和敏感性突变是代谢流导向和设计育种的有效手段, 代谢流量分析将成为设计育种的提供新思路。     

家兔脊神经节内肥大细胞与肽能神经关系的观察

探讨脊神经节内肥大细胞与肽能神经的关系,采用常规组织学染色和免疫组织化学方法对家兔脊神经节内肥大细胞和P物质免疫阳性反应进行观察。结果显示：在P物质免疫反应阳性的神经元和神经纤维周围散在着肥大细胞,表明,脊神经节内,肥大细胞与肽能神经存在着组织形态学上的构筑关系。     

L-组氨酸产生菌的选育及其特性的初步研究

以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)HZ4221(TRARDCPR AMTRhistidase-)为出发菌株,利用亚硝基胍(NTG)诱变选育得到莽草酸缺陷型的渗漏突变株CLW0560,在以葡萄糖为碳源、硫酸铵为氮源的培养基中直接发酵72h,积累L-组氨酸可达5.31g/L。与亲株相比,L-组氨酸产量提高了32.1%,转酮酶比活力下降84.3%。研究了该菌株利用培养基中碳源情况及菌株遗传稳定性,而且考察了金属离子对CLW0560的影响。     

L-丝氨酸生产菌的选育及不同碳源对发酵的影响

以一株黄假单胞属(Pseudomonas flava)菌株A3为出发菌株,经过紫外(UV)诱变和硫酸二乙酯(DES)逐级诱变处理和选育,选育出一株能够以甲醇为唯一碳源的兼性甲基营养型菌JW-01(Mth^R、Gly^R)。在含甘氨酸30g/L、甲醇1%的发酵培养基中发酵3d后L-丝氨酸产量为6．2g/L,较出发菌株提高了67．6%。该菌具有较好的传代稳定性。