一种新型的重组单链三特异抗体的构建与表达

双特异抗体由于其缺乏共刺激信号 ,激活的T细胞往往会导致凋亡。为了更有效地杀伤肿瘤细胞 ,构建了抗卵巢癌单链×抗CD3单链×抗CD2 8单域重组三特异抗体的表达载体。利用大肠杆菌中的分子伴侣FkpA与三特异抗体共表达 ,提高了三特异抗体的在BL2 1Star菌中的可溶性原核表达。ELISA结果显示 ,可溶性的重组单链三特异抗体 (sTRI)与SK OV 3细胞的膜抗原 ,Jurkat细胞上的CD3分子以及重组CD2 8抗原均有较强的结合活性。桥连试验证明该抗体能同时与SK OV 3细胞和Jurkat细胞结合。体外杀伤试验表明该抗体能激活外周血T细胞来杀伤肿瘤细胞。形态学观察也进一步说明该抗体具有良好的结合活性以及体外杀伤活性。这种新型的重组单链三特异抗体为基于T细胞的癌症免疫治疗建立了一个新的技术平台。     

贺兰山东麓优良本土酿酒酵母筛选及发酵特性分析

【背景】商业酵母的使用造成葡萄酒同质化问题严重,发掘优良本土酿酒酵母具有十分重要的意义。【目的】从168株宁夏本土酿酒酵母菌株中筛选出性能优良、具有出色葡萄酒发酵能力的菌株。【方法】基于杜氏管发酵试验和乙醇、高糖等耐受性试验分析产H2S能力及生长曲线测定的方法,筛选出发酵力好、耐受性强、低产H2S的本土酿酒酵母进行赤霞珠葡萄酒发酵试验,测定葡萄酒样基础理化指标、酚类物质和挥发性成分,探究筛选出的酿酒酵母发酵特性。【结果】初步筛选出发酵快速,能适应13%乙醇、350 g/L葡萄糖、250 mg/L SO2、pH 1.0的生存环境且低产H2S的4株本土酿酒酵母YC-E8、QTX-D17、QTX-D7、YQY-E18。菌株YC-E8产甘油能力强,所发酵酒样香气与商业酵母XR、F33最为接近,适用于赤霞珠葡萄酒的发酵。菌株QTX-D17发酵酒样中酒精、单宁、总酚和花色苷含量最高,表现出本土酿酒酵母优良的发酵特性。菌株QTX-D7所发酵酒样香气中乙酸乙酯、辛酸乙酯、1-壬醇等物质含量较高,赋予了葡萄酒香蕉味、苹果味、菠萝味、椰子味等愉悦花果香。【结论】最终筛选出3株优良本土酿酒酵母QTX-D17...     

大肠杆菌二硫键形成相关蛋白的结构、功能及其在基因工程表达外源蛋白上的应用

大肠杆菌分泌蛋白二硫键的形成是一系列蛋白协同作用的结果,主要是Dsb家族蛋白,迄今为止共发现了DsbA、DsbB、DsbC、DsbD、DsbE和DsbG。在体内,DsbA负责氧化两个巯基形成二硫键,DsbB则负责DsbA的再氧化。DsbC和DsbG负责校正DsbA导入的异常二硫键,DsbD则负责对DsbC和DsbG进行再还原,DsbE的功能与DsbD类似。除了直接和二硫键的形成相关外,DsbA、DsbC和DsbG都有分子伴侣功能。它们的分子伴侣功能独立于二硫键形成酶的活性并且对二硫键形成酶活性具有明显的促进作用。基于Dsb蛋白的功能特性,利用它们以大肠杆菌为宿主表达外源蛋白,特别是含有二硫键的蛋白,取得了很多成功的例子。本文简要介绍了这方面的进展,显示Dsb蛋白在促进外源蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达方面具有广阔的应用前景。     

U937细胞中GATA1调控c-myb基因表达

c-myb是血细胞生成过程中的一个重要转录因子,与造血干细胞的增殖、分化、凋亡有关.在白血病、结肠癌、乳腺癌和黑色素瘤等恶性肿瘤中,c-myb异常表达,但是在白血病细胞中c-myb调控的机制尚不清楚.本研究探究了U937细胞中GATA1与c-myb的调控关系,可能对白血病研究和治疗提供帮助.用12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)诱导U937细胞分化,并检测分化前后GATA1与c-myb蛋白的变化.Western blot结果显示U937细胞经TPA诱导分化后c-myb与GATA1蛋白均明显下降.利用慢病毒包装GATAl shRNA质粒和GATA1过表达质粒并感染到U937细胞中实现转录因子GATA1的敲降及过表达后,检测c-myb的mRNA和蛋白的表达水平.结果 显示:敲降GATA1后,c-myb的mRNA和蛋白质水平明显下降;过表达GATA1后,c-myb的mRNA和蛋白质水平明显上调.本研究揭示了U937细胞中GATA1对c-myb的正向调控关系,为白血病研究和治疗方案提供了新的思路.     

蛋白内含子介导纯化的表达载体的构建及应用

将抗膀胱癌单链抗体(PG)融合在蛋白内含子(intein)的C末端,利用intein的N末端具有的chitin binding domain(CBD)对几丁质柱的吸附特性及intein的自切割活性对PG进行一次性纯化。同时,引入大肠杆菌分子伴侣肽基脯氨酰顺反异构酶(FkpA)与目的蛋白进行共表达及融合表达,以使目的蛋白以可溶形式存在。结果显示,PG融合蛋白对几丁质柱的吸附效率很高,intein的自切割释放PG的效率也较高,但PG仅出现在SDS洗脱液中。FM与PG共表达能显著地提高目的蛋白的可溶性。Intein介导的纯化系统前景远大。     

一种构建改形单域抗体的方法

为验证一种构建改形单域抗体的实用新方法,与以往方法不同的是,该方法不需要对抗体进行空间结构模拟,以确定人源抗体的FRs接受序列及在人源FRs接受序列中哪些氨基酸残基需要突变,并且该方法将抗体的改形与亲和力成熟于同一过程完成,利用该方法构建了改形抗CD28重链单域抗体,根据一种鼠源抗CD28重链单域抗体的氨基酸序列,于GenBank中查得两条与之最同源的人源抗体序列,利用其中一条的FRs作为改形抗体的主框架进行改形构建,将鼠源抗体的CDR区插入到人源FR区后,对人源FR区的一些氨基酸残基进行替换突变,替换的氨基酸残基数及替换原则主要是根据对查到的人源抗体序列,鼠源抗体序列,以及这些序列与Kabat分类中的种属序列进行的比较,为了增加改形抗体基因的多样性,对要被替换的氨基酸残基在基因合成中采用简并的方式,使要被替换的氨基酸残基和替换的氨基酸残基都有机会出现,二者出现的几率各为50%,同时,在将大小不同的合成核苷酸片段采用重叠PCR扩增以获得完整改形抗体基因时,采用高Mg^2 浓度下和使用TaqDNA聚合酶,以进一步随机引入突变,利用重叠PCR产物构建了一个噬菌体抗体库,经过3轮淘选后,获得了几个具有较高免疫学活性的改形抗体,对其中的两个抗体进行了进一步研究,将两个抗体的基因在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,复性后的表达蛋白仍具有较高的免疫学活性,结果表明该方法是有效可行的。