应用脂质体介导技术改变重组杆状病毒感染方法

昆虫重组杆状病毒表达系统是有效的真核表达系统之一,广泛应用于重组蛋白的生产。目前常采用将重组病毒直接注射入家蚕体内的方法进行感染表达,在实际操作过程中很容易造成病毒对环境的污染,具有潜在的危险性。为了严格控制作业环境重组病毒的扩散和潜在污染,开发安全、有效的感染方法显得非常必要。本研究直接将病毒基因组DNA导入家蚕体内取得同样的感染效果,探讨了利用阳离子脂质体介导下的避免病毒污染和提高感染效果的感染方法。     

家蚕血液过氧化氢酶活力及其与蚕体抗逆性的关系

家蚕召Bombyx mori(L.)血液过氧化氢酶(CAT)活力随发育时期呈现有规律的动态变化。在幼虫期,CAT活力以龄初、龄末较高,而龄中较低;化蛹后,CAT活力迅速上升,至中期达到峰值,随后迅速下降直至羽化。不同性别间CAT活力均以雄性较高;不同蚕品种间CAT活力有很大差异;饲料对CAT活力有一定影响,人工饲料育蚕CAT活力略大于桑叶育的;高温冲击和氟化物添食都能引起CAT活力的显著变化,但变化的幅度因品种、性别、时期和添食剂量而有所不同。研究认为,家蚕血液CAT活力与其发育变态、体内代谢均具有密切关系,逆境条件下CAT活力变化幅度的大小可以作为家蚕抗逆性强弱的一个重要生理指标。     

饲料中维生素和无机盐对rBmNPV-Bm表达系统植酸酶基因表达活性的影响

【目的】为查明宿主的营养对重组家蚕杆状病毒-家蚕表达系统(rBmNPV-Bm)外源基因表达活性的影响,探寻提高家蚕Bombyx mori生物反应器产率的新途径。【方法】以家蚕BmNPV病毒为表达载体,以人工饲料饲养的5龄家蚕为宿主,以植酸酶基因为报告基因,探讨了家蚕人工饲料中维生素和无机盐对外源基因表达产物活性的影响。【结果】家蚕血淋巴中外源植酸酶的活性随着饲料中维生素和无机盐添加量的不同而发生显著变化。在本试验设区范围内,当维生素C的含量为饲料干物质量的1 %,B族维生素混合物为0.25 %,无机盐混合物为1 %,维生素B6为100 g饲料干物中含2 mg时,血淋巴中植酸酶活性达到最大值。【结论】通过改变家蚕饲料中微量营养成分的含量是提高rBmNPV-Bm表达系统外源基因表达活性的有效途径。     

家蚕味觉电生理反应的个体差异

为探讨家蚕Bombyx mori人工饲料饲养发育不齐的生理原因,从同一蚕品种中挑选出对人工饲料摄食性不同的个体,用电生理学方法测定了下颚瘤状体味觉感器对4种代表性物质（蔗糖、肌醇、大豆粉提取物和柠檬酸）的电生理反应。结果表明,栓锥感器Ss-Ⅰ对蔗糖等促食物质的反应以及栓锥感器Ss-Ⅱ对大豆粉提取物等阻食物质的反应,均存在明显的个体差异。在临界浓度下,低摄食性个体的放电脉冲频率显著高于高摄食性个体。说明低摄食性蚕的味觉反应比高摄食性蚕敏感。     

松阿扁叶蜂对不同树种挥发物的触角电位反应

用MS302生物信号记录分析系统,以顶端记录法测定松阿扁叶蜂成虫对不同树种挥发性物质的EAG反应。结果显示,该蜂成虫对其嗜好的油松、赤松、华山松挥发物的EAG反应敏感,雌成虫放电频率分别为45.2次/s、42.1次/s、42.3次/s,电位值依次为1 022 mV、1.139 mV、0.706 mV, 但对其非寄主树种的侧柏挥发物反应微弱,对空气无反应。雌成虫对油松挥发物的不同气流量17 mL/s、17 mL/s、85 mL/s的放电频率和电位值分别为24.8次/s、45.2次/s、46.6次/s和0.533 mV、1.022 mV、1.316 mV,表明EAG反应程度因挥发物气流量浓度不同而变化。触角电位与选择性行为的测试结果基本一致,表明松阿扁叶蜂在寄主选择过程中,触角的嗅觉功能起着重要作用。     

家蚕蛹和成虫期GOBP/PBP亚家族基因簇基因定位与表达分析

昆虫的气味结合蛋白（odorant binding proteins, OBPs）在昆虫与外界环境化学信息交流过程中起着重要作用, 对昆虫觅食、求偶、繁殖具有重要意义。普通气味结合蛋白/性信息素结合蛋白（general odorant binding protein/ pheromone binding protein, GOBP/PBP）是鳞翅目昆虫OBP家族的一个重要单系群。为进一步明确家蚕Bombyx mori GOBP/PBP基因的结构、表达及功能, 本研究利用染色体定位及半定量表达分析方法对其进行了分析。染色体定位分析显示, 这些基因以基因簇的形式存在于第19染色体的nscaf3052上, 基因结构相似, 转录方向一致, 表明这些基因可能由同源基因复制产生, 并具有类似功能。对家蚕蛹和成虫不同发育阶段的雌、雄虫多种组织中进行表达分析发现, 这些基因的表达在不同发育时期和不同组织间差异明显（P<0.05）, 相对表达量均以触角中为最高, 其他非嗅觉组织中也多有表达, 性别间差异不大, 说明了该基因簇基因除了具有嗅觉相关的功能外, 很可能具有其他尚未被发现的功能。     

对人工饲料摄食性不同的家蚕品种Cph2基因的表达特征分析

家蚕Bombyx mori不同品种对人工饲料的摄食性存在很大差异。为探讨食性差异的分子机理, 本文基于对人工饲料摄食性不同的蚕品种（系）SAGE （serial analysis of gene expression）文库差异表达基因的分析, 发掘了1条家蚕假定表皮蛋白（cuticular protein hypothetical）基因BmCph2。采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR方法, 对BmCph2在不同摄食性蚕品种（系）不同发育时期的表达特征进行了研究。结果表明： BmCph2基因在家蚕幼虫眠期和起蚕期高表达, 在胚胎期和幼虫将眠期几乎检测不到表达; 在幼虫头部与全蚕的表达特征相似, 而在中肠中表达活性很低, 推测该基因表达可能与家蚕新表皮的形成有关。BmCph2在对人工饲料摄食性不同的蚕品种（系）中的表达存在较大差异, 在摄食性好的高食性品种中表达量显著低于摄食性差的低食性品种; 饲料和忌避剂的气味刺激及取食刺激对不同品种（系）该基因的表达有不同的影响, 高食性蚕对诱导刺激比较敏感, 而低食性蚕受影响较小, 尤其是菁松A和菁松B的低食性品系几乎不受影响。本研究结果说明, BmCph2基因除可能参与表皮形成的同时, 还与家蚕的食性有密切关系, 但其具体机理有待于进一步研究。     

家蚕素Ⅱ基因原核表达及蛋白纯化

【目的】建立一种简便、 快速且能大量获得家蚕素Ⅱ （bombyxin-Ⅱ, BBXⅡ）的有效方法。【方法】运用RT PCR技术得到bombyxin-Ⅱ基因全长cDNA序列, 采用原核表达技术对该基因进行异源表达, 并利用亲和层析的方法得到纯化的BBXⅡ蛋白。【结果】从家蚕Bombyx mori头部mRNA中经过反转录获得bombyxin-Ⅱ基因的cDNA, 并构建了原核表达载体pET28a-BBXⅡ, 经过异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导, 使BBXⅡ获得了大量表达, 进一步用HisTrap HP亲和层析, 成功得到大量纯化的BBXⅡ。【结论】本实验建立的原核表达方法和蛋白纯化技术, 是大量制备BBXⅡ的一种简易而有效的方法, 为进一步开展BBX的分泌机制和作用机理研究, 以及利用原核表达系统研发BBX降血糖药物奠定了基础。     

更换饲料对家蚕幼虫肠道细菌组成的影响及关键物种与产茧性能的相关性

【目的】本研究探讨使用人工饲料部分替代桑叶饲育后家蚕Bombyx mori幼虫肠道细菌群落的变化情况,并分析人工饲料替代桑叶的不同饲育模式下肠道关键细菌与蛹重和茧层量的相关性,为人工饲料部分替代法饲育家蚕的实际应用提供理论依据。【方法】采用全龄桑叶育(Mul1-5)、1-2龄人工饲料育+3-5龄桑叶育(Art1-2)、1-3龄人工饲料育+4-5龄桑叶育(Art1-3)、1-4龄人工饲料育+5龄桑叶育(Art1-4)和全龄人工饲料育(Art1-5) 5种饲养模式饲养家蚕幼虫,统计5种饲养模式下家蚕的全茧量、茧层量及蛹重;收集不同饲养模式下家蚕5龄幼虫肠道样品,通过高通量测序技术分析其肠道菌群的组成和多样性差异,采用Spearman相关性热图分析肠道细菌与蛹重和茧层量的相关性。【结果】人工饲料与桑叶不同搭配的饲育模式对家蚕茧质有显著的影响,Mul1-5和Art1-5的全茧量最高,二者无显著性差异,Art1-2其次; Mul1-5茧层量最高,Art1-2其次,Art1-5茧层量最低。在不同饲育模式下,家蚕肠道细菌多样性和组成显著不同：在门水平上,Art1-2和Mul1-5的细菌组成最相近,优势菌主要是变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes),而Art1-3, Art1-4和Art1-5的细菌组成最相近,变形菌门丰度随着人工饲料饲养时间的增加逐渐增加,厚壁菌门的丰度则呈现相反的趋势;在属水平上,家蚕肠道优势菌属有假单胞菌属Pseudomonas、肠球菌属Enterococcus、鞘脂单胞菌科未分类菌属Sphingomonadaceae unclassified及罗尔斯通菌属Ralstonia等。不同饲育模式下家蚕肠道菌属丰度差异最大的是肠球菌属,Art1-2组中肠球菌属丰度最高(40.9%),随着人工饲料饲养时间的延长,丰度逐渐降低,在Art1-5中仅为0.02%。家蚕肠道菌群大部分关键物种均与茧质呈一定的相关性：柯克斯体属Coxiella与蛹重呈显著正相关,与茧层量呈显著负相关;葡萄球菌属Staphylococcus与蛹重呈显著负相关;肠球菌属与茧层量呈显著正相关。【结论】饲育模式Art1-2最接近于Mul1-5,可为人工饲料部分替代桑叶饲育法饲育家蚕提供参考。人工饲料部分替代桑叶后家蚕肠道菌群结构发生了显著变化,肠球菌属丰度的显著降低及假单胞菌属的显著增加可能与全龄人工饲料养家蚕体质弱有关;一些关键细菌与家蚕蛹重和茧层量存在显著相关性,其影响机制需要进一步研究。     

家蚕蛹-成虫变态期中肠和涎腺超微结构变化与功能

为进一步明确家蚕Bombyx mori变态期间消化系统的生理功能以及溶茧酶的来源器官,通过透射电镜观察和酶活性检测,对家蚕蛹 成虫变态期中肠和涎腺的超微结构、水解酶活力以及中肠内容物的变化进行了观察和分析。结果表明: 蛹第7日到羽化前1日家蚕中肠细胞和刚羽化成虫的涎腺细胞中,均可观察到大量的分泌泡、分泌颗粒、微绒毛等分泌细胞的结构特征以及活跃的分泌现象。潜成虫的中肠和涎腺中都存在活性较高的水解酶活力,其中每毫克中肠组织中蛋白酶活力、酯酶活力和纤溶酶活力分别为726 U、751 U和263 U,每毫克涎腺组织中上述3种酶的活力分别为603 U、523 U和147 U,说明中肠和涎腺可能都具有分泌溶茧酶的功能。家蚕蛹期中肠内容物的主要成分是蛋白质、脂质和糖,三者占内含物总量的95%以上,其中蛋白质含量占78.8%～80.2%。中肠内容物的重量在刚化蛹时为20.1～21.9 mg/头,化蛹后7日内无明显变化,化蛹第9日内容物重量减少63.01%～66.17%,到成虫羽化时已所剩无几,可能是因内容物被消化吸收所致。据此推测,在家蚕变态期中肠还具有贮存和释放营养物质的功能,而溶茧酶的另一个功能可能是分解消化中肠内容物。