应用硫氧还蛋白促进外源蛋白在大肠杆菌的可溶性表达

为了观察硫氧还蛋白（ＴｒｘＡ）促进外源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的作用,我们从质粒ｐＥＴ－３２ａ（＋）上克隆了ｔｒｘＡ基因,构建了ＴｒｘＡ表达质粒ｐＴ－ＴｒｘＡ。将该质粒与其它蛋白基因的表达质粒共同转化Ｅ．ｃｏｌｉ并同时获得表达。结果表明,共表达ＴｒｘＡ可以明显促进外源蛋白,如甲状旁腺激素相关蛋白（ＰＴＨｒＰ）、ＰＴＨｒＰ受体（ＰＴＨｒＰ－Ｒ）的血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）的可溶性表达。说明共表达     

可溶性人肿瘤坏死因子受体Ⅱ（sTNFRⅡ）在大肠杆菌中的表达及其活性检测

肿瘤坏死因子（TNF）是一种多功能性的细胞因子,与许多重大疾病有关。为了抑制TNF的生物学活性,将TNF受体Ⅱ胞外区在大肠杆菌中进行了可溶性表达,并通过金属螯合层析柱纯化重组蛋白。结果表明,纯化的重组蛋白能够识别并结合TNF,同时能中和TNF的生物学活性,抑制其对细胞的杀伤作用,具有潜在的临床应用前景。     

甲状旁腺素相关蛋白cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达*

采用RT-PcR方法从中国人肾癌细胞株中克隆到甲状旁腺素相关蛋白(Parathyroidhonnnoe related protein,PTHrP)cDNA,其核苷酸序列与国外发表资料相比,有6个核苷酸不同．其中仅92位密码子的不同导致氨基酸变异．即由脯氨酸变为丝氨酸。将克隆的PTHrPcDNA插到原核表达载体pET一3a的T7噬菌体启动子下游,转化大肠杆菌后得到高效表达,并经Western blot和生物学活性检测对表达产物作了鉴定。     

血管内皮细胞生长因子受体Flt-1胞外区基因的克隆及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

从原代培养的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)提取细胞总RNA,采用逆转录PCR(RT-PCR)方法得到VEGF受体Flt-1胞外区前3个IgG样区域cDNA片段(Flt-1n3).将获得的受体基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,得到重组质粒pcDNA3.1/Flt-1n3,通过脂质体转染方法将其转入中国仓鼠卵巢细胞(CHO),用G418筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞克隆.经固相结合实验筛选得到表达与VEGF特异结合的目的蛋白的细胞克隆,细胞测活结果表明,表达产物具有抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的活性.鸡胚测活结果表明,CHO细胞表达的r Flt-1n3能抑制鸡胚绒毛尿囊膜的血管形成.     

TNF受体（P55）胞外区基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

TNF与多种疾病密切相关。为了获得大量具有生物学活性的可溶性TNF受体用以拮抗TNF的毒性作用,在原核表达系统中表达了TNFR（P55）的胞外区与TrxA的融合蛋白。将TNFR（P55）胞外区去信号肽的前三个结构域基因克隆入融合蛋白表达载体pET-32a,在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达了TrxA-TNFR融合蛋白。表达产物以包涵体形式存在,经过变性和复性,并经镍金属鳌和柱亲和层析纯化,得到了纯度较高的可溶性受体蛋白的初纯品。免疫学实验及L929细胞体外实验均表明：该蛋白具有TNFR（P55）特异的抗原性、与TNF结合的活性以及良好的抑制TNF的TNF生物学活性。