重组阳离子抗肿瘤肽AIK的原核表达、纯化及活性测定

利用Gateway克隆技术构建重组抗瘤肽AIK的原核表达体系,建立表达及纯化重组AIK的最优条件,为深入研究和利用AIK奠定基础。首先,设计含AttB重组位点的引物,通过重叠PCR技术扩增出Att B-TEV-FLAG-AIK序列,利用BP重组反应将目的序列TEV-FLAG-AIK克隆到供体载体pDONR223中,构建入门载体,再通过LR重组反应,将目的序列转移到目的载体pDEST15中,构建GST-AIK融合蛋白原核表达质粒。随后,在BL21(DE3)工程菌中优化诱导融合蛋白表达的条件。以谷胱甘肽磁珠纯化GST-AIK融合蛋白,再以rTEV酶切除GST,获得FLAG-AIK重组蛋白。最后以MTS法检测FLAG-AIK对白血病细胞HL-60的细胞毒性。菌液PCR验证和测序分析表明成功构建了重组抗瘤肽AIK的入门质粒和原核表达质粒。在BL21(DE3)工程菌中实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达。并测得在37℃下以0.1 mmol/L IPTG诱导工程菌(OD600=1.0)4 h,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的30%以上。经GST亲和层析、rTEV酶切除GST标签及二次GST亲和层析获得纯度高于95%的FLAG-AIK蛋白。MTS法测得所制备的FLAG-AIK蛋白抑瘤活性与化学合成的AIK相当。总之,本课题应用Gateway克隆系统成功构建了抗瘤肽AIK的原核表达质粒,实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达,经亲和层析获得了有生物活性的重组AIK多肽,为后续深入研究和大规模制备奠定了基础。     

肝细胞生长因子对人羊水干细胞迁移和黏附能力的影响

目的分离培养及鉴定羊水干细胞（hAFSC）,并研究肝细胞生长因子（HGF）对羊水干细胞迁移、黏附能力的影响。方法使用细胞贴壁法分离培养羊水干细胞,细胞免疫荧光及westernblot鉴定羊水干细胞,Transwell小室分析HGF对羊水干细胞迁移的作用。明胶贴壁法分析HGF对羊水干细胞黏附能力的作用。两组之间数据的比较采用独立样本t检验。结果分离的羊水干细胞均表达特异性标记物Oct-4、c-kit、SSEA-4、CD105。HGF在体外对hAFSC的迁移有趋化作用,对照组和HGF组每个视野的迁移细胞数分别为38±2.5和80±3.2。对黏附能力有促进作用,对照组和HGF组每个视野的黏附细胞数分别为19±1.5和50±2.7,差异均有统计学意义（P〈0.01）。结论 HGF可趋化羊水干细胞的迁移,增强羊水干细胞的黏附能力。