伪狂犬病毒闽A株基因文库的构建及物理图谱分析

本文报道以质粒ｐＢＲ３２２作载体,用鸟枪法克隆出了ＰＲＶ闽Ａ株除ＢａｍＨＩ－１,２外的所有酶切片段,构建了ＰＲＶ闽Ａ株基因文库,并以克隆出的ＢａｍＨＩ片段用光生物素标记作探针,应用分子杂交法确定了ＰＲＶ闽Ａ株绝大部分限制性内切酶位点的位置。     

PCR检测伪狂犬病病毒DNA

 根据伪狂犬病病毒 (PRV)gB基因的序列 ,设计并合成了一对引物 ,以闽A株细胞培养毒为模板 ,筛选最佳反应条件 ,建立了检测PRV的PCR方法 应用该方法对Fb、Bartha、BJ、GD、V2F4、S、S3、SR、Buk、Shope、Norden、MinkⅢ、HB、F8、F9、F12等毒株的细胞培养液进行基因扩增 ,均获得了分子量为 2 81bp的特异性目的DNA片段 ,而对Vero细胞与FMDV、SVDV、HCV、PRRSV、JEV、PPV等病毒进行检测 ,结果均为阴性 ,没有出现交叉反应 对PRV毒株扩增的产物测序 ,结果序列与文献报道一致 ,证明PCR扩增产物和方法的特异性 对 1994～ 2 0 0 0年期间送检的临床样品和保存的PRV毒种 ,用病毒分离、双抗体夹心ELISA和PCR等 3种方法进行检测 ,结果前 2种方法检测为阳性的 ,PCR检测均为阳性 ;PCR检测为阴性 ,前 2种方法检测也为阴性 ;可是 ,前 2种方法检测为阴性的 ,PCR却检测出部分阳性 ;经x2 检验 ,证明PCR检出率明显高于前 2种方法的检出率 对PRV闽A株细胞毒提取物DNA进行检测 ,其最低检出量为 15 8pg 对 1999～ 2 0 0 0年期间广东、福建、海南等省的 31个大中型猪场送检的 191份病料进行检测 .结果病料阳性率为 2 6 2 % ( 50 191) ,猪场阳性率为 71% ( 2 2 31) 实验结果表明 ,所建立的PCR技术可用于伪狂犬病的快速诊断     

检测伪狂犬病的PCR方法的建立及其在临床诊断中的应用

根据文献,通过计算机分析设计并合成了1对用于扩增伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)gB基因281bp片段的引物,上游引物(P1)位于gB基因的1827～1851位,下游引物(P2)位于gB基因的2083～2107位.以PRV闽A株细胞培养毒为模板,筛选最佳反应条件和试剂工作浓度,建立了检测PRV的PCR方法.应用该方法对保存的16株伪狂犬病强弱毒株的细胞培养液进行基因扩增,均获得了281bp的特异性目的DNA片段.可是,对正常细胞与其它6种引起猪病毒性疫病相关病毒进行检测,结果均为阴性,没有出现交叉反应.对扩增产物测序,结果序列与文献报道一致,证明PCR扩增产物和方法的特异性.对PRV闽A株细胞毒提取物DNA进行检测,其最低检出量为15.8pg.用病毒分离、双抗体夹心ELISA和PCR等3种方法检测1994～2000年期间送检的临床样品和保存的PRV毒种,对所获得的结果进行χ2分析,证明PCR检出率明显高于前2种方法.对1999～2001年期间广东、福建、海南等省的76个大中型猪场送检的348份病料进行检测,检出阳性病料68份,病料阳性率为19.54%;检出阳性猪场27个,猪场阳性率为35.53%.对27个阳性猪场分析发现,种猪场阳性率为7.41%(2/27),商品猪场阳性率为92.59%(25/27).PRV在自然发病猪体内分布较广,脑、肾、肺、脾、肝、淋巴结均有PRV的存在,PRV检出率最高的组织为脑,其检出率为5/5,依次为肾12/15、肺9/16、脾10/20、肝7/18、淋巴结4/11等.实验结果表明,所建立的PCR技术可用于伪狂犬病的快速诊断和流行病学调查.     

伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段在Pichia pastoris中的表达

伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白E是一种在伪狂犬病根除计划中具有重要作用的糖蛋白.将伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZαA中,获得的重组表达载体pPICZαA-FL电击转化野生型酵母菌SMD1168后,得到多株酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL.经高浓度ZeocinTM筛选、表型鉴定、工程菌的诱导表达及表达产物的鉴定,最后得到高效表达gE基因去信号肽片段的酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL-7.工程菌72 h培养上清的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与蛋白质印迹结果显示,gE基因去信号肽片段表达产物大小约为80 ku,比预期的63.8 ku大.凝胶薄层扫描结合Bradford蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的13.49%,表达量可达11.7 mg/L.间接ELISA结果表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效地区分伪狂犬病病毒gE标准阳性与阴性血清.     

应用RT-PCR技术检测动物组织中的口蹄疫病毒*

通过对影响RT-PER检出率的条件和试剂进行了筛选,确定了提取FMDV RNA的最佳方法和试剂,优选出RT-PCR反应的试剂和最佳反应条件,建立了检测口蹄疫病毒核酸的RT-PER方法。应用所建立的方法检测送检的鲜牛奶、淋巴结、脊髓、牛鼻咽拭子,结果阳性率分别为41.4％(24/58)、13.33％(2/15)、20％(1/5)、37.5％(12/32);检测4个屠宰场送检的组织样品40份,结果阳性率为.10％-70％;检测送检的奶粉(1份)、水泡皮(1份)、老鼠(2份)、患儿口腔棉拭子(4份),阳性率均为     

应用RT-PCR技术检测动物组织中的口蹄疫病毒

通过对影响RT-PCR检出率的条件和试剂进行了筛选,确定了提取FMDVRNA的最佳方法的试剂。优选出RT-PCR反应的试剂和最佳反应条件,建立了检测口蹄疫病毒核酸的RT-PCR方法,应用所建立的方法检测送检的鲜牛奶,淋巴结,脊髓,牛备咽拭子,结果阳性率分别为41.4%(24/58),13.33%(2/15),20%(1/5),37.5%(12/32);检测4个屠宰场送检的组织样品40份,结果阳性率为10%——70%;检测送检的奶粉（1份）,水泡皮（1份）,老鼠（2份）,患儿口腔棉拭子（4份）,阳性率均为100%;而检测送检的蝉螂4份,阳性率为0。研究表明检测FMDV的RT-PCR技术能准确快速地检测肉类,奶类,分泌物,排泄物的带毒,排毒情况,可用于口蹄疫的诊断和流行病学调查。     

伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段在Pichia pastoris中的表达

伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白E是一种在伪狂犬病根除计划中具有重要作用的糖蛋白.将伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段克隆到巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体pPICZαA中,获得的重组表达载体pPICZαA-FL电击转化野生型酵母菌SMD1168后,得到多株酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL.经高浓度Zeocin^TM筛选、表型鉴定、工程菌的诱导表达及表达产物的鉴定,最后得到高效表达gE基因去信号肽片段的酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL-7.工程菌72 h培养上清的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与蛋白质印迹结果显示,gE基因去信号肽片段表达产物大小约为80 ku,比预期的63.8 ku大.凝胶薄层扫描结合Bradford蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的13.49%,表达量可达11.7 mg/L.间接ELISA结果表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效地区分伪狂犬病病毒gE标准阳性与阴性血清.     

非甲非乙型肝炎:黑猩猩和人血清病毒样粒子的检测

<正>目前,NANB肝炎的病原体仍不清楚。已有报道NANB肝炎成功地转染给黑猩猩,但没有描述病原体的特征,电镜和血清学试验也未检查到病毒样粒子(VLP)。最近,据宣布:加州福尼亚生物技术公司Chiron已分离到NANB肝炎病毒,但未作详细报道。本篇通迅报道了在具有NANB肝炎的黑猩猩和人血清中VLP的检测情况。 血清样品来自实验性感染NANB肝炎的六只黑猩猩。用输血后感染肝炎的一个病例所分离出的NANB肝炎病原体F株接种动物后,均发生NANB肝炎所特有的肝细胞管状结构持续阳性三年多的慢性肝炎;并且已发现来自一只黑猩猩的少量慢性期血清(接种后49—51周)在受体黑猩猩中引起肝炎,这显示肝细胞管状结构持续阳性是NANB肝炎病毒携带者的重要标志。在人的病例中,10例在临床     

伪狂犬病新型疫苗研究进展

伪狂犬病是多种家畜和野生动物的一种重要传染病,给世界畜牧业特别是养猪业造成了巨大的经济损失,疫苗免疫是预防控制该病的主要手段。综述了伪狂犬病亚单位疫苗,核酸疫苗,重组疫苗,基因缺失疫苗等新型疫苗的研究进展。     

副溶血弧菌海产品和临床分离株的表型及溶血素相关基因分析

副溶血弧菌是(Vibrio parahaemolyticus)常见的食源性病原菌,可污染多种水产品,并引起人的食物中毒,其致病性与溶血素密切相关,如直接耐热溶血素(TDH)、TDH-相关溶血素(TRH)、不耐热溶血素(TLH)。用PCR方法对分离自浙江省部分地区的副溶血弧菌临床和海产品分离株的3种溶血素基因进行检测。结果表明,所有副溶血弧菌菌株均可检测到tlh基因;11株临床分离株均检测到tdh基因,而42株水产品分离株中只有1株检出tdh基因,携带tdh的分离株神奈川试验(KP)均为阳性。所有分离菌株中均未检测到trh基因以及其尿素酶试验呈阴性,由此可知trh基因可能与尿素酶基因连锁。副溶血弧菌分离株中致病性相关毒力因子TDH的阳性率极低,然而副溶血弧菌性食物中毒发生率较高,它们之间的关系及其发病机制还有待深入研究。