趋化因子受体CX3CR1调控人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的作用研究

目的:探究趋化因子受体CX3CR1调控人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的作用和机制,为钙化性主动脉瓣膜疾病的早期干预和治疗提供新思路。方法:取非钙化主动脉瓣(3例)和钙化主动脉瓣(5例),免疫组织化学染色检测成骨相关转录因子Runx2、骨桥蛋白OPN和骨钙蛋白OCN的表达;取3例非钙化的主动脉瓣,采用胶原酶连续消化法分离人主动脉瓣膜间质细胞,观察细胞形态及生长状态,并采用细胞免疫荧光进行表型鉴定。对成骨诱导培养的人主动脉瓣膜间质细胞分别过表达和干扰趋化因子受体CX3CR1,平行设置CM组、OM组和negative control+OM组,采用qPCR和Western blot检测Runx2、OPN和OCN的表达,Western blot检测AKT和p-AKT的表达。茜素红S染色评价晚期钙结节形成情况。结果:临床标本显示钙化的主动脉瓣较非钙化的主动脉瓣高表达CX3CR1(P 0. 05);成功分离人主动脉瓣膜间质细胞,α-SMA和Vimentin阳性,vWF阴性。与CM、OM、negative control组比较,CX3CR1+OM组Runx2、OPN和p-AKT表达上调(P 0. 05),且茜素红S染色可见明显钙结节;与CM、OM、negative siRNA control+OM组比较,si CX3CR1+OM组Runx2、OPN和p-AKT表达下调(P 0. 05),且茜素红S染色可见钙结节减少。结论:趋化因子受体CX3CR1可能通过AKT信号通路促进人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化。     

人血清淀粉样蛋白SAA1 蛋白的原核重组表达

目的:重组及表达人血清淀粉样蛋白SAA1融合蛋白,为进一步制备早期诊断冠心病的单克隆抗体做准备。方法:应用PCR技术,以成人肝脏的c DNA文库做模板,扩增出长度为315 bp的人血清淀粉样蛋白SAA1基因,并将其分别与带有HIS标签的PET-32a载体及GST标签的PGEX-4T-1载体连接,转化入DH5α感受态细胞中进行克隆并测序鉴定。并在大肠杆菌表达菌BL21菌中表达SAA1融合蛋白,之后分别应用SDS-PAGE及Western blot技术检验重组蛋白的纯度。结果:经SDS-PAGE凝胶电泳后,我们分别看到了分子量为32k D和分子量为38k D的两个蛋白条带,这两个条带分别为PET-32a-SAA1重组蛋白和PGEX-4T-1-SAA1重组蛋白,且这两种蛋白在超声后存在于菌液的沉淀中,证明在大肠杆菌中实现了不溶性的包涵体形式的表达,经Western blot鉴定,分别以HIS标签抗体和GST标签抗体为第一抗体,以鼠二抗为第二抗体,证明所表达的蛋白质为SAA1融合蛋白。结论:采用原核表达方法,经免疫纯化可获得高纯度的SAA1融合蛋白,为进一步制备相应的单克隆抗体和开发以SAA1增高为指标之一的冠心病诊断试剂盒打下基础,为冠心病的诊断开辟新途径。