FHL家族的克隆及其融合蛋白的纯化

目的:纯化FHL家族(FHL1～FHL5)融合表达蛋白。方法:用PCR方法从乳腺文库和卵巢文库中扩增FHL1～FHL5编码序列,将其以正确相位与pGEX-KG载体中的GST编码序列融合,将重组质粒分别转化E.coliDH5α后,用谷胱甘肽-Sepharose4B纯化融合蛋白,并用Westernblot检测融合蛋白的表达。结果:构建得到FHL1～FHL5的融合表达载体,West-ernblot检测表明GST-FHL1～GST-FHL5共5种融合蛋白均成功表达,并纯化得到融合蛋白。结论:成功克隆FHL1～FHL5基因,并得到纯化的融合蛋白。     

乳腺癌易感蛋白BRCA1的BRCT2结构域染色质伸展活性的定位

40 %～ 5 0 %的遗传性乳腺癌和至少 80 %的既有乳腺癌又有卵巢癌家族史的患者是由BRCA1突变引起的 .BRCA1C末端含有 2个BRCT结构域 (BRCT1和BRCT2 ) ,它们与BRCA1的重要功能密切相关 .许多乳腺癌易感突变发生在BRCA1的BRCT结构域中 .利用染色质结构检测技术表明 ,BRCT结构域具有染色质伸展活性 .利用缺失突变技术构建了 6种BRCT2结构域 (175 6～ 185 2位氨基酸残基 )缺失突变体并将BRCT2结构域中与染色质伸展相关的重要区域定位到 175 6～ 180 8之间的氨基酸残基 ;用丙氨酸扫描技术构建了 6种BRCT2结构域丙氨酸扫描突变体并将重要氨基酸残基序列定位到 1784～ 1788之间的VQLCG .BRCT2结构域的定位有助于预测BRCT2结构域突变后发生乳腺癌的风险 ,也为进一步研究BRCT2结构域的功能机制提供了有用的材料 .     

肝癌细胞雌激素受体显性阴性突变体ERδ5基因的分离及生物学功能分析

临床流行病学研究显示,ERα基因第5外显子缺失突变体ERδ5在原发性肝细胞癌特异性高表达,它被认为是判断肝癌预后的最重要的新型分子标志.本研究从肝癌细胞分离雌激素受体突变体ERδ5基因,并对其进行克隆、表达,探讨其分子生物学特性及生物学功能. 通过反转录PCR,从肝细胞分离出ERδ5基因并将其克隆到真核表达载体,通过体外翻译及Western 印迹验证该基因成功表达;通过细胞荧光技术检测了ERδ5在肝细胞中的定位;利用荧光素酶报告基因检测技术确证ERδ5对ERα转录活性的影响.结果发现,从肝癌细胞分离出长1 113bp的ERδ5基因,该基因编码蛋白在体外不稳定,易于降解.在肝癌细胞中,ERδ5蛋白主要定位在细胞核,与ERα定位极为相似,但在生物学功能上,ERδ5能够明显干扰ERα的转录活性.研究结果表明,ERδ5作为显性阴性突变体,在肝癌细胞中直接抑制ERα的转录活性.     

利用RNA干扰抑制具有多种剪接形式的RNA结合蛋白基因的表达

目的:构建具有多种剪接形式的RNA结合蛋白(RBPMS)基因siRNA的真核表达载体,观察其对RBPMS表达的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术,设计并合成了2条针对RBPMS基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上。将重组质粒和带FLAG标签的RBPMS共转染293T人胚肾细胞,通过Western印迹检验RNAi效应。结果:测序证明成功构建了RBPMSsiRNA真核表达载体;Western印迹表明构建的siRNA能有效地抑制RBPMS基因的表达。结论:构建了RBPMSsiRNA的真核表达载体,该siRNA能有效地抑制RBPMS基因的表达。     

红细胞生成素受体功能域的研究及其意义

红细胞生成素受体是细胞因子受体超家族成员之一,它在红细胞生成素诱导的红系祖细胞的存活,增殖,分化的过程中起着重要的调节作用,本文概述了红细胞生成素受体３个功能域的结构,主要功能及其在医药研究中的重要意义。     

XBP-1和Erα存在相互作用

雌激素受体α(Erα)是乳腺癌治疗的靶标和预后的指标。在乳腺癌中,人X盒结合蛋白1(XBP-1)与Erα共表达,并在一些乳腺肿瘤中过表达。这些结果提示,XBP-1与Erα可能存在相互作用。XBP-1由于剪切方式不同,产生两种形式的XBP-1,即XBP-1S和XBP-1U。体外GST沉淀实验表明,XBP-1S和XBP-1U均能结合Erα,XBP-1S的结合能力大于XBP-1U。体内免疫共沉淀实验也表明,XBP-1S和XBP-1U以激素不依赖的方式与Erα结合。Erα通过其DNA结合结构域与XBP-1S和XBP-1U结合,而XBP-1S和XBP-1U通过其N末端的亮氨酸拉链结构域和C末端的转录激活结构域与Erα相互作用。这些结果提示,XBP-1S和XBP-1U可能通过与Erα的相互作用参与雌激素受体信号途径。     

人防御素HNP-1基因在原核系统中的克隆与表达

通过化学合成法制备人防御素 HNP- 1基因 ,并将其构建于带有 GST基因的表达载体中 ,进行融合表达 ,表达融合蛋白可占菌体蛋白的 70 %左右 ,且主要以包含体形式存在。改变培养条件可适当提高可溶性融合蛋白的比例。融合蛋白通过凝胶色谱进行纯化 ,然后经凝血酶切释放出防御素多肽 ,并通过抑菌试验对其活性进行检测。结果显示 ,可能由于分子间的二硫键错配造成了防御素分子构象改变 ,使制备的防御素分子未显示出活性     

Xenorhabdus和Photorhabdus代谢产物体外抗肿瘤活性

用8株昆虫病原线虫共生菌(Xenorhabdus属和Photorhabdus属)的发酵液进行了体外抗肿瘤活性的研究,从中筛选出活性较高的菌株一嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila CB6)。经有机溶剂萃取和硅胶柱层析对嗜线虫致病杆菌发酵液进行进一步分离,得到5个组分。用MTT法测定体外杀肿瘤细胞作用,发现其中2个组分具有抗肿瘤活性。组分3对HepG2、Hela、BGC-823、A-549、K562和HT-29的IC50分别等于3．1μg／ml、8．5μg／ml、2．1μg／ml、3．0μg／ml、4．4μg／ml和1．5μg／ml;组分5对HepG2、Hela、BGC-823、A-549、K562和HT-29的IC50分别等于0．1μg／ml、1．8μg／ml、0．1μg／ml、0．4μg／ml、1．2μg／ml和0．6μg／ml。同时发现抗肿瘤活性组分对正常人肺成纤维细胞MRC-5和正常人肝细胞L-02生长的影响很小。该研究在国内率先报道了嗜线虫致病杆菌发酵液具有较强抗肿瘤活性,为新药物的研制和开发提供了一条崭新的途径。     

XBP-1在乳腺癌细胞株中的表达及其在ERα信号途径中的作用

雌激素受体(ERα)在乳腺癌的发生发展过程中起重要作用。在乳腺癌中,人X盒结合蛋白-1(XBP-1)与ERα共表达,并在一些乳腺肿瘤中过表达。最近发现xBP—l有两种剪切形式,即XBP-1S和XBP-1U,但它们在乳腺癌细胞中的表达形式和在ERα信号途径中的作用还不清楚。采用RT-PCR技术,检测到XBP-1的两种剪切形式在正常乳腺细胞株和不同乳腺癌细胞株中均表达。利用ERE-LUC报告基因,检测XBP-1S和XBP-1U在乳腺癌细胞株MDA-MB-435中对ERα转录活性的影响表明,它们均以激素不依赖但以XBP-1剂量依赖的形式提高ERα的转录活性。XBP-1S的活性高于XBP-1U。XBP-1S和XBP-1U高效提高ERE-LUC报告基因的活性依赖于ERα的存在。结果提示．XBP-1S和XBP-1U可能通过ERα信号途径在乳腺癌的发生发展中起重要作用。