批次和流加培养中国仓鼠卵巢工程细胞的细胞周期相关基因转录谱分析

以表达人重组尿激酶原中国仓鼠卵巢 (CHO) 工程细胞系11G-S为研究对象,运用基因芯片技术比较了CHO工程细胞在批次及流加培养不同生长阶段基因表达水平的差异,在此基础上采用Genmapp软件,同时结合已知的细胞周期信号通路图,着重分析了批次及流加培养CHO工程细胞的细胞周期调控基因转录谱差异。在基因芯片涉及的19 191个目标基因中,批次和流加培养不同生长阶段CHO工程细胞的下调表达的基因数量多于上调表达基因数目;两种培养模式下的基因差异表达有着明显的不同,尤其是在细胞生长的衰退期,流加培养CHO工程细胞中下调表达的基因数量明显多于批次培养。有关调控细胞周期关键基因的转录谱分析表明,CHO工程细胞主要是通过下调表达CDKs、Cyclin及CKI家族中的Cdk6、Cdk2、Cdc2a、Ccne1、Ccne2基因及上调表达Smad4基因,来达到调控细胞增殖及维持自身活力的目的。     

中国仓鼠卵巢工程细胞无血清流加培养关键工艺参数的考察

主要考察流加培养基中不同营养成分、流加起始时间及初始接种密度对11G-S细胞无血清流加培养的影响。在研究中以悬浮适应的表达尿激酶原 (Pro-urokinase,Pro-UK) CHO工程细胞系11G-S为研究对象,在100 mL的摇瓶中无血清悬浮流加培养11G-S细胞,同时以活细胞密度、细胞活力及Pro-UK活性为评价依据。结果表明在培养基中氨基酸、无血清添加成分及无机盐对促进细胞生长、细胞活力维持及蛋白表达起着较为重要的作用;且流加起始时间为72 h及初始接种密度为3×105~4×105 cells/     

基于流式细胞术分选的高效表达外源基因细胞的筛选

目的：以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为报告基因,用流式细胞术筛选高表达EGFP的细胞,从而获得外源基因高效表达细胞株。方法：构建在EGFPC端编码区融合新霉素（neomycin）抗性基因的融合基因EGFP-Neomycin,将其插入pcDNA3.1（＋）载体,构建EGFP-Neomycin融合基因表达载体pcDNAEN,转染CHO-K1细胞,G418加压筛选和倒置荧光显微镜观察证实所表达的EGFP-Neomycin融合蛋白具有新霉素抗性和激发EGFP荧光双功能;将编码组织型纤溶酶原激活剂（tPA）的cDNA插入pcDNAEN中CMV启动子下游,构建表达tPA的表达载体pcDNAEN/tPA。结果：流式细胞术分析和tPA纤维蛋白溶解活性测定表明,pcDNAEN/tPA转染CHO-K1细胞的EGFP相对荧光强度（RFT）的自然对数值与tPA表达水平呈明显的直线相关关系,相关系数为0.983;比较部分未经流式细胞仪分选的pcDNAEN/tPA转染阳性细胞克隆和RFT分布在100～1000的pcDNAEN/tPA转染阳性细胞克隆的tPA表达水平,经流式细胞术分选获得的细胞克隆的tPA平均表达水平和最高表达水平分别是未经分选获得的细胞克隆的3.9倍和4.1倍。结论：构建的EGFP-Neomycin融合基因具有双功能,建立了利用流式细胞术筛选外源基因高效表达物细胞株的方法。     

搅拌式生物反应器培养促进拟胚体的形成及其向心肌细胞分化

目的：摸索搅拌式生物反应器培养小鼠胚胎干细胞（mESC）的最佳条件,建立一种批量制备拟胚体（EB）的方法。方法：研究mESC不同接种密度及生物反应器初始搅拌速度对EB形成的数量和质量的影响,以细菌培养皿中形成的EB为对照,用抗坏血酸诱导其向心肌细胞分化,比较两种培养体系对EB心肌细胞分化潜能的影响,通过免疫荧光染色及RT PCR对ESC来源的心肌细胞进行鉴定。结果：当mESC接种密度为1×105~3×105个/ml,搅拌速度设定为15~30r/min时,搅拌式生物反应器能高效制备出大量相对均一的EB,EB中几乎没有坏死细胞。与细菌培养皿制备的EB相比,生物反应器培养的EB向心肌细胞分化的效率更高,并表达心肌特异性基因。结论：搅拌式生物反应器培养促进EB的形成及其向心肌细胞分化,是一种更为理想的EB培养系统。     

hTERT基因组成型过量表达的Vero细胞系的建立

目的:建立组成型过量表达hTERT的Vero细胞系。方法:从质粒pCI-neo-hTERT酶切、分离纯化hTERT cDNA,克隆入phEF/chMAR-hyg载体中,构建重组真核表达质粒phEF/chMAR-hyg-hTERT。采用脂质体转染法转染Vero细胞,经潮霉素筛选、克隆分离培养,用RT-PCR检测转染阳性细胞克隆的hTERT mRNA表达丰度,Western blotting验证高丰度表达hTERT mRNA克隆的hTERT表达。用Cedex AS20细胞密度和活力分析系统考察过量表达hTERT Vero细胞在组织培养板中批次培养的生长特性。结果:从phEF/chMAR-hyg-hTERT转染阳性细胞中筛选出hTERT mRNA和蛋白高丰度表达的Vero细胞系(Vero-T1),Vero-T细胞在批次培养中后期的细胞密度和活力均高于野生型Vero细胞。结论:成功建立了hTERT基因组成型过量表达的Vero细胞系,为探索以组成型过量表达hTERT的技术途径改善细胞培养特性、提高病毒疫苗生产工艺水平奠定了基础。     

一种基于荧光强度分析的高通量定量检测细胞凋亡方法

根据正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞的细胞膜对核酸荧光染料的不同选择通透性,用4μmol/L YO-PRO-1（YP）和4μg/ml 碘化丙啶（Propidium iodide, PI）染色96孔板中的细胞样品。分别在485/538 (Ex/Em, nm) 和530/590 (Ex/Em, nm) 的检测波长下借助荧光分光光度计检测细胞样品孔的YP和PI荧光强度。将YP和PI荧光强度值与用荧光显微镜对同一细胞样品细胞凋亡和坏死的定量分析结果相对应,通过对YP荧光强度值与凋亡细胞数的直线回归分析 (r = 0.999,P<0.01),得到依据YP荧光强度值求得凋亡细胞数的直线相关方程。该方法可检测出样品中少至180个的凋亡细胞,具有灵敏度高和快速高效的特点。     

用YO-PRO-1和PI联合染色定量检测细胞凋亡

经不同浓度staurosporine处理诱导凋亡的G7细胞样品,分别用YO-PRO-1/PI和AV/PI进行荧光染色,借助流式细胞仪检测凋亡情况,将两种检测方法得到的结果进行统计学分析显示,二者有显著的相关性(r=0.9659,P<0.01),且没有显著性差异(P<0.05);另外,上述凋亡细胞样品经YO-PRO-1/PI染色后在荧光显微镜下计数凋亡细胞比例的结果与AV/PI流式细胞仪的检测结果也有显著的相关性(r=0.9903,P<0.01),且没有显著性差异(P<0.05)。以上这些结果表明,用YO-PRO-1/PI对细胞进行染色、借助流式细胞仪和荧光显微镜均能准确地检测细胞凋亡,可替代AV/PI流式细胞仪方法用于细胞凋亡的检测。     

一种基于三顺反子表达载体的生物素诱导表达系统的建立

目的：建立一种以无毒的生物素为诱导剂的哺乳动物细胞诱导表达系统。方法：通过基因组PCR或重叠延伸PCR获得该系统的三个基本构件：大肠杆菌生物素连接酶（BirA）、链亲和素-四环素依赖的抑制因子融合蛋白（SA-TetR）和生物素化信号-VP16转录激活结构域融合蛋白（Avitag-VP16）。将上述基因连入三顺反子表达载体,与响应载体一起共转染293f细胞,以EGFP为报告基因,检测EGFP荧光强度随培养体系中生物素浓度变化的情况。结果：随着生物素浓度的增加,目的基因表达出现OFF-ON-OFF的变化,诱导状态下的EGFP荧光强度约为抑制状态下的3倍。结论：可通过调节生物素浓度对目的基因的表达进行可逆的调节,该系统是一种有应用前景的诱导表达系统。     

诱导表达p27对HEK293细胞生长代谢的影响

目的：研究诱导表达p27对HEK293细胞生长和代谢的影响。方法：将pTet—on载体和响应于Dox的p27诱导表达载体共转染HEK293细胞,随机挑选单克隆细胞株。以细胞周期分布和活细胞密度为主要观察指标,考察稳定转染的细胞在Dox诱导下的细胞生长;以Qglc、Qlac和Qgln为主要观察指标,考察转染细胞在Dox诱导下的细胞代谢。结：p27基因的表达使HEK293细胞的增殖速度显著降低,G1期细胞比例显著升高,葡萄糖消耗和乳酸生产减少。结论：诱导表达p27基因是对HEK293细胞进行G1期阻滞的一种有效策略。