绿色荧光蛋白与人肾脏NaDC3融合基因的构建及其在肾小管上皮细胞中的定位

本采用RT-PCR方法从人的正常肾组织中扩增出hNaDC3基因全长cDNA序列,采用基因重组技术将hNaDC3基因和绿色荧光蛋白基因融合,通过真核表达质粒—脂质体介导,导入LLC-PKl细胞系,激光共聚焦显微镜动态观察GFP—hNaDC3的定位情况。结果显示PKGFP-C3空白质粒转染的LLC—PKl细胞表达了GFP,GFP在胞内分布以核浆为主,呈均匀致密的细颗粒荧光,胞核染色强,核仁荧光稀少,界线清楚。而pKGFP-C3-hNaDC3转染细胞株的绿色荧光蛋白,转染后第1天混合分布于细胞浆和细胞膜,以粗颗粒荧光为主,两界限不清楚,胞浆中可见未染色的圆形空洞,未见胞核染色;第3天主要聚集于细胞膜,核周的胞浆中可见粗颗粒荧光物质,胞浆和胞膜界线清楚,胞核亦未见绿色荧光蛋白;第5天清晰聚集于细胞膜,细胞膜连接至网状。因此hNaDC3蛋白在细胞质中生成后,定位于细胞膜并稳定表达。     

人钠依赖性二羧酸转运蛋白2(hSDCT2)的组织表达谱分析

利用DNA重组技术 ,构建重组表达质粒pGEX hSDCT2 .IPTG诱导其表达后 ,采用谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析 ,获得纯化的谷胱甘肽S 转移酶 (GST) hSDCT2重组融合蛋白 .以此为免疫原免疫兔制备GST hSDCT2融合蛋白抗体 .多组织Northern印迹法结果显示 ,3 6kb的hSDCT2基因转录产物 ,在心、骨骼肌、胸腺、小肠、肺和外周血白细胞等组织中几乎不表达 ,在脑、结肠、脾、肝和胎盘中仅有少量表达 ,但在肾脏中大量表达 ;并且在肾脏和脾脏中还存在着另一种约 4 3kb的转录产物 .Western印迹法证实 ,hSDCT2蛋白以类似方式于上述组织表达 .免疫组化双重染色结果发现 ,与分布于近端肾小管刷状缘的hSDCT1不同 ,hSDCT2主要分布于近端肾小管的基底膜侧 .这些结果为进一步研究人钠依赖性二羧酸转运蛋白 2的结构和功能奠定了基础 .