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目的:构建alpha珠蛋白基因片段反义表达载体,抑制重型beta地贫患者alpha珠蛋白基因的过量表达,为重型beta地贫基因治疗打下基础。方法:采用PCR扩增alpha珠蛋白基因片段807bp,反应条件94℃ 30s,68℃ 1min,72℃ 2min,35个循环,然后将所扩增片段用Klenow大片段酶补平PCR产物末端,另外用HindⅢ酶切pLNSX,用Klenow补平后,与补平末段的PCR产物平端连接,转化用CaCl2制备的感受态细胞受体DH5α,用碱法提取所得克隆子质粒,电泳比较质粒大小,再用PCR初筛,最后用双酶切进行鉴定。结果:经过质粒大小比较,PCR初筛,双酶切鉴定,得到6个正向插入重组子。 相似文献
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建立特异性单引物PCR,并用于筛选基因克隆重组子。根据α-globin的一段序列设计引物,按照设计好的特性单引物PCR扩增条有α-globin的重组质粒PLNSX-aglobin,具体扩增条件如下:(1)97℃5min变性后,94℃30s,70℃2min30s,30个循环,制备单链模板;(2)94℃1min,12℃5min,16℃3min,18℃3min,20℃3min,22℃3min,25℃1min,30℃3min,37℃3min,72℃6min,低温条件下引物3′端4-5个碱基与所扩单链模板退火配对,扩增得到一系列不同起始位点但同一序列末端长短一的核酸片段;(3)以上述所得片段为模版进行如下条件的扩增:94℃30min,70℃2min,70℃2min,72℃2min,每个循环增加1s),45个循环。结果,特异性单引物PCR能够从pLNSX-αglobin上扩增出特异带,可有效用于筛选基因克隆重组子。 相似文献
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目的:采用改良法克隆淋球菌特征核酸片段300bp到pBS.sk中,作为淋球菌检测试剂盒的阳性标本来源。方法:采用PCR扩增淋球菌特征核酸片段300bp,扩增条件:94℃30s,55℃1min,72℃1min,35个循环,另外用SmalI酶切,pBS,sk,与PCR产物采用改良法平端连接:连接温度14℃,72h,连接反应体积15μl,加10u SamlⅠ防止pBS.sk自连,连接完成后取5μl连接液转化200μlCaCl2制备的感受态受体菌JM109,用碱法提取重组子质粒,电泳比较质粒大小,PCR初筛,最后双酶切鉴定。结果:经过电泳比较质粒大小,PCR初筛,最后双酶切鉴定。结果:经过电泳比较质粒大小,PCR初筛,最后双酶切鉴定,得到5个克隆重组子。 相似文献
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建立一种简单的人血基因组PCR反应扩增模板制备及其保存方法,用于α-globin基因HS40位点扩增。 相似文献
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从两例鼻咽癌(NPC)病人的活检组织切片中,用PCR方法扩增出EB病毒潜伏感染膜蛋白(LMP)基因的Exonl、Introl ExonΠ和IntronΠ共500bp的片段,克隆入载体pGEM-3zf(+)′,测定核苷酸序列,其中有一个样品所测序列段与台湾析相似,另一个样品则与B95-8极为相似。由此可知。中国陆南方的NPC组织中EBV-LMP基因存在不同的变异。 相似文献
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