参与调控意大利蜜蜂工蜂中肠基因表达的东方蜜蜂微孢子虫miRNA的组学解析及其调控网络

【目的】本研究结合前期已获得的miRNA和mRNA组学数据对东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的差异表达miRNA(differentially expressed miRNA, DEmiRNA)靶向意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂中肠的mRNA和差异表达mRNA(differentially expressed mRNA, DEmRNA)进行生物信息学预测、数据库注释和调控网络分析,旨在解析东方蜜蜂微孢子虫对意大利蜜蜂工蜂中肠的基因表达调控。【方法】比较东方蜜蜂微孢子虫感染7 d(AmT1)和10 d(AmT2)的意大利蜜蜂工蜂中肠和未感染中肠(分别为AmCK1和AmCK2)的mRNA数据,筛选意大利蜜蜂工蜂的显著性DEmRNA;通过比较侵染AmT1和AmT2的东方蜜蜂微孢子虫(分别为NcT1和NcT2)和东方蜜蜂微孢子虫纯净孢子(NcCK)的miRNA数据筛选出东方蜜蜂微孢子虫的DEmiRNA。利用TargetFinder软件预测东方蜜蜂微孢子虫DEmiRNA靶向的意大利蜜蜂工蜂中肠DEmRNA。利用相关生物信息学工具对上述意大利蜜蜂工蜂中肠靶DEmRNA进行GO和KEGG数据库注释。根据KEGG数据库注释信息筛选出意大利蜜蜂工蜂中肠免疫防御和能量代谢通路相关DEmRNA,并构建和分析上述DEmRNA与相应的东方蜜蜂微孢子虫DEmiRNA之间的调控网络。【结果】NcCK vs NcT1比较组中东方蜜蜂微孢子虫的77条显著上调miRNA和52条显著下调miRNA可分别靶向AmCK1 vs AmT1比较组中意大利蜜蜂工蜂中肠的118条显著下调mRNA和135条显著上调mRNA,这些mRNA可分别注释到31和25个GO条目,以及113和107条KEGG通路。NcCK vs NcT2比较组中东方蜜蜂微孢子虫的52条显著上调miRNA和49条显著下调miRNA可分别靶向AmCK2 vs AmT2比较组中意大利蜜蜂工蜂中肠的97条显著下调mRNA和210条显著上调mRNA,这些mRNA可分别注释到27和30个GO条目以及97和127条KEGG通路。NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2比较组中的11条共同显著上调miRNA和19条共同显著下调miRNA分别靶向AmCK1 vs AmT1和AmCK2 vs AmT2比较组的6条共同显著下调和14条共同显著上调mRNA,可分别注释到7和10个GO条目以及0和9条KEGG通路。NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2比较组中东方蜜蜂微孢子虫的DEmiRNA可靶向AmCK1 vs AmT1和AmCK2 vs AmT2比较组中意大利蜜蜂工蜂中肠的氧化磷酸化和硫代谢等能量代谢通路相关DEmRNA,以及胞吞作用、黑色素生成、溶酶体、自噬、Toll样受体信号通路、细胞凋亡、Ras信号通路、泛素介导的蛋白水解和MAPK信号通路等免疫防御通路相关DEmRNA。进一步分析发现,miR-216-x, miR-5119-y, bantam-y和miR-8-y在NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2比较组中皆显著上调表达,且靶向意大利蜜蜂工蜂中肠的溶酶体、黑色素生成、泛素介导的蛋白水解、MAPK信号通路及Ras信号通路等免疫防御通路相关的显著下调mRNA。【结论】在侵染过程中,东方蜜蜂微孢子虫的DEmiRNA对意大利蜜蜂工蜂的基因表达具有广泛的潜在影响,东方蜜蜂微孢子虫可能通过上调部分miRNA跨界调控意大利蜜蜂工蜂的免疫防御以促进侵染,通过下调部分miRNA跨界调控意大利蜜蜂工蜂的能量代谢以加强能量窃取并促进增殖。     

基于small RNA组学分析揭示意大利蜜蜂响应东方蜜蜂微孢子虫胁迫的免疫应答机制

【目的】通过深度测序和组学分析在small RNA组学层面揭示意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)响应东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)的免疫应答机制。【方法】利用small RNA-seq技术对正常及N. ceranae胁迫7 d和10 d的意蜂工蜂中肠(Am7CK、Am7T、Am10CK和Am10T)进行深度测序。利用相关生物信息学软件对测序数据进行质控、已知micro RNA (mi RNA)鉴定、新mi RNA预测及mi RNA的结构特征分析。通过Stem-loop RT-PCR验证新mi RNA的表达。按照|log2(Fold change)|≥1和P≤0.05的标准筛选出Am7CKvs.Am7T和Am10CKvs.Am10T比较组的差异表达mi RNA(differentially expressed mi RNA,DEmi RNA)。利用软件预测DEmi RNA靶向结合的m RNA并进行GO和KEGG数据库注释,根据注释信息对细胞和体液免疫相关通路及富集靶m RNA进行统计和分析。根据靶向结合关系构建DEmi RNA和免疫通路相关差异表达m RNA (differentially expressed m RNA,DEm RNA)的调控网络。采用RT-q PCR对数据的可靠性和DEmi RNA的差异表达进行验证。【结果】共获得165895574条原始读段和132028990条有效序列标签,各组的组内Pearson相关性平均在87.92%及以上。共鉴定到928个已知mi RNA和56个新mi RNA。这些mi RNA的长度介于18–28nt,多数的长度为18nt和22nt且首位碱基主要偏向U。验证了12个新mi RNA的真实表达。Am7CKvs.Am7T比较组包含48个上调mi RNA和36个下调mi RNA;Am10CK vs. Am10T比较组包含56个上调mi RNA和51个下调mi RNA。两个比较组的DEmi RNA可分别靶向结合9827个和10720个m RNA。这些靶m RNA可分别注释到50和47条功能条目,以及138和135条KEGG通路。DEmi RNA与免疫通路相关靶m RNA的调控网络分析结果显示,Am7CK vs. Am7T中有26个DEmi RNA靶向与内吞作用等免疫通路相关的10个DEm RNA;Am10CK vs. Am10T中有15个DEmi RNA靶向与MAPK信号通路等免疫通路相关的10个DEm RNA。验证了测序数据和4个DEmi RNA差异表达的可靠性。【结论】研究结果揭示了宿主DEmi RNA可能通过调控物质和能量代谢、细胞和体液免疫对N. ceranae产生应答,但DEmi RNA不参与抗菌肽基因的表达调控;mi R-1-z可能参与宿主的细胞增殖、细胞凋亡和免疫进程;氧化磷酸化通路可能在宿主免疫应答及宿主-病原互作中发挥特殊作用。