龙葵抗阿特拉津生物型叶绿体基因文库的建立

用对阿特拉津(Atrazine)除草剂抗性的龙葵生物型B_(12)株系作材料,制备叶绿体DNA。B_(12)株ctDNA(叶绿体DNA)经BamHI酶解,在0.7％琼脂糖凝胶电泳上呈现24条带,其中最大的片段为18.6kb,最小的片段为1kb。用pBR322作为载体,构建B_(12)株ctDNA BamHI片段文库。通过与探针的分子杂交,从中筛选出含有编码叶绿体32kd蛋白质的阿特拉津抗性基因的克隆pSB135和含有ATP合酶α亚单位基因的克隆pSB132。     

除草剂作用机制的生物化学与生物技术的应用

除草剂在解决草害中起着突出作用,其年产量及销售值已跃居农药之首,使用面积与日俱增。随着大量除草剂的出现,新品种开发难度愈益增大,如50年代商品化一个品种的化合物筛选比例为1/2000,70年代1/7000,80年代为1/20000。目前,从活性化合物的发现到投放 市场,约需研究开发费一万美元,耗时年,因此,扩大现有除草剂的应用范围是一个重要问题,而选育抗药性作物品种则是重要的领域。     

阿特拉津降解菌株的分离、鉴定和工业废水生物处理试验

用液体无机盐培养基富集培养法和无机盐平板直接分离法, 从生产阿特拉津的农药厂的废水和污泥混合物中分离到13个能以阿特拉津为唯一氮源生长的细菌菌株。通过16S rRNA基因序列分析, 11个菌株被鉴定为Arthrobacter spp., 2个菌株被鉴定为Pseudomonas spp.。对阿特拉津降解活力最高的Arthrobacter sp. AD30和Pseudomonas sp. AD39的降解基因组成和降解特性进行了详细研究。降解基因的PCR扩增表明, AD30和AD39都含有trzN-atzBC基因, 能将有毒的阿特拉津降解成无毒的氰尿酸。降解实验表明, 向阿特拉津浓度为200 mg/L的无机盐培养基中分别接种等量的AD30、AD39和这两个菌株的混合菌液, 30°C振荡培养48 h以后, 阿特拉津去除率分别为92.5%、97.9%和99.6%, 表明混合菌的降解效果好于单菌。用AD30和AD39的混合菌液接种阿特拉津浓度为176 mg/L的工业废水, 30°C振荡培养72 h以后, 99.1%的阿特拉津被去除, 表明混合菌株在阿特拉津工业废水的生物处理中有很好的应用潜力。     

阿特拉津降解菌ATR3的分离鉴定与土壤修复

阿特拉津因效率高、价格低廉，是我国玉米田施用最广泛的除草剂之一，但其结构稳定，残留时间长，因此对生态环境和人类健康造成了一定的危害。从长期受阿特拉津污染的玉米田土壤中筛选并鉴定阿特拉津降解菌，明确其在不同类型土壤中的去除能力。对分离出的阿特拉津降解菌ATR3进行生理生化分析和16S rRNA序列鉴定，确定菌株ATR3为节杆菌属（Arthrobacter sp.）。该菌株以阿特拉津为唯一氮源，培养48 h后对1 000 mg/L阿特拉津的去除率达到97%以上。敏感作物盆栽试验结果表明，阿特拉津在棕壤上去除最快，褐土次之，黑土最慢，说明阿特拉津在土壤中的去除过程与土壤本身的理化性质呈相关关系。同时，该菌株处理14 d后，能明显恢复玉米的各项生物学指标，说明该菌株对阿特拉津污染土壤具有良好的修复能力。为阿特拉津降解菌剂的推广利用提供参考。     

阿特拉津及其降解菌的使用对土壤微生物群落的影响

比较了阿特拉津及降解菌株BTAH1的使用对土壤微生物的影响.结果表明，在实验周期内阿特拉津对土壤微生物的代谢作用有较明显的刺激作用，与空白土壤(未施用阿特拉津和降解菌)相比，对照土壤(施用50 mg·kg^-1土阿特拉津)呼吸强度显著增加,且土壤中的阿特拉津浓度对土壤NH₄⁺-N和NO₃^--N浓度的影响显著.降解菌BTAH1可在1周内降解土壤中98%以上的阿特拉津，从而使土壤呼吸强度有所下降，土壤中NH₄⁺-N和NO₃^--N的浓度基本与空白土壤持平，对微生物量C和微生物量N影响不显著；放线菌和真菌数量也基本与空白持平，细菌数量较高.对土壤细菌的16S rDNA文库的ARDRA分析发现，阿特拉津及其降解菌的使用对土壤细菌群落结构有一定程度的影响，阿特拉津的使用会降低细菌群落的多样性，而降解菌的使用会恢复土壤细菌的多样性.     

阿特拉津高灵敏酶联免疫吸附检测法的建立

目的：建立高灵敏度的阿特拉津酶联免疫吸附检测法。方法：将间接竞争ELISA进行条件优化以提高检测灵敏度，包括包被抗原与一抗的最佳工作浓度筛选、选择一抗的最佳稀释度对包被抗原进行细化筛选、不同有机溶剂对竞争结合反应的影响、酶标二抗稀释度筛选等。用建立的酶联免疫检测法检测实际样品，再与高效液相色谱法（HPLC）检测进行比较。结果：利用优化后条件建立了阿特拉津间接竞争ELISA检测曲线，标准曲线的相关系数R²=0.9958，相关性较好。另由此标准曲线可得LOD （最低检出限）为1.972 ng/ml。用于检测实际样品，回收率在80%-120%之间。当添加样品浓度为（0~6） ng/ml时，该法的检测灵敏度高于HPLC。结论：新建立的阿特拉津ELISA特异性好、精密度高，可代替大型仪器用于阿特拉津实际样品检测。     

阿特拉津降解菌SA1的分离鉴定及其降解特性研究

为进行阿特拉津(AT)污染的生物修复,从AT降解混合菌群中,经长期的交替液体摇瓶培养和平板划线分离,筛选到一株能完全降解AT的菌株SA1。经生理生化特征及16S rDNA序列分析,将该菌鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。与已报道的AT降解菌Pseudomonas sp.ADP不同,SA1能以AT为唯一碳源、氮源和能源生长,培养基中添加铵盐不抑制SA1的降解功能,而添加葡萄糖时,累积的氰尿酸会被快速降解。SA1生长的最适温度为37℃,最适pH值为7.0。SA1的静息细胞在10℃~40℃或pH值4~11时均能高效降解AT,比ADP降解具有更广的pH和温度范围,表明SA1降解菌株具有广阔的应用前景。SA1中AT降解基因为保守的atzABCD,并含有IS1071的tnpA基因片段,传代过程中降解基因会以一定频率丢失。     

阿特拉津降解菌Acinetobacter sp.DNS32对无机氮源的响应

【目的】研究Acinetobacter sp.DNS32的生长、阿特拉津降解能力和降解基因转录水平的表达对无机氮素的响应关系,为菌株的工程应用提供指导与理论基础。【方法】以Acinetobactersp.DNS32为对象,采用摇瓶法研究菌株在阿特拉津培养基中菌株生长情况及降解能力对外加硝态氮与铵态氮的响应关系,利用荧光定量PCR技术检测DNS32降解基因表达量对外加无机氮源的响应关系。【结果】外加无机氮源可以促进DNS32菌株的生长,提高阿特拉津降解能力,无机氮源对DNS32菌株的trzN、atzB和atzC 3种降解基因表达均有促进作用,加入无机氮源的试验处理中DNS32菌株trzN基因的表达量最高可达对照的11.252±2.408倍,推断DNS32菌株的这3种降解基因所编码的酶是稳定表达的组成酶。【结论】DNS32降解阿特拉津不受"氮饥饿"诱导机制调控,且无机氮源的存在对菌株的生长与降解有促进作用,因此菌株在土壤修复实践中具有广阔的应用前景。     

阿特拉津降解菌SYSA的分离筛选和鉴定

从长期施用阿特拉津的土壤中筛选到1株能够以阿特拉津为惟一碳源生长的菌株SYSA,经生理生化特性鉴定和16S rDNA序列分析,该菌为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae).对SYSA菌的生物学特性研究表明,pH 7-8,30℃时,在以阿特拉津(20 mg/L)为惟一碳源的培养基上经146 h培养,降解率为87%.     

抗atrazine转基因大豆的抗性遗传及某些生理、农艺性状

抗ａｔｒａｚｉｎｅ基因导入大豆植株后不仅在Ｆ１代获表达，且已遗传到后代（１９９年已至Ｆ７代）。通过正交与反交试验证明，其Ｆ１代植株对ａｔｒａｚｉｎｅ的抗性性状均与其母本性状一致，即该性状为母系遗传，为细胞质基因，位于叶绿体ＤＮＡ上。通过导入抗性基因株与未导入抗性基因的对照株的光合速率测定、成分分析及农艺性状（株高、百粒重、单株产量）测定表明，两类植株间无明显差异。在喷施ａｔｒａｚｉｎｅ情况下，转基因株能表现出抗性。