HCMV IE86对恶性胶质瘤细胞凋亡及p53表达活性的影响

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)能诱导肿瘤细胞恶性转化且抑制肿瘤细胞凋亡,但HCMV编码的主要即刻早期调控蛋白IE86在这一过程中是否发挥关键作用仍然未知。为探究IE86对基因修饰荷胶质瘤小鼠p53表达水平及恶性胶质瘤细胞凋亡情况的影响,本研究通过PCR技术鉴定基因修饰小鼠IE86表达情况;实时定量PCR技术检测IE86和p53mRNA表达水平变化;免疫组织化学方法检测p53和p21蛋白的表达水平;TUNEL检测肿瘤组织细胞凋亡情况。结果显示,成功构建了IE86基因修饰小鼠模型;与IE86阴性组相比IE86阳性组p53表达水平上升(P0.05),但p21表达水平下降(P0.05);IE86阳性组细胞抗凋亡能力增强(P0.05)。以上结果表明,在基因修饰的小鼠中IE86持续表达但p53转录活性的指示标志p21下调,且IE86可提高恶性胶质瘤细胞抗凋亡能力。     

融合蛋白M-IL-2(~(88)Arg,~(125)Ala)在毕赤酵母中的表达及抗肿瘤活性研究

构建融合基因蜂毒肽(melittin)与人变构白介素2(M-IL-2(88Arg,125Ala))毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA/M-IL-2(88Arg,125Ala),转化毕赤酵母菌株KM71H,甲醇诱导筛选出的多拷贝阳性菌株表达融合蛋白,纯化融合蛋白,并进行初步的抗肿瘤活性研究。经测序及PCR鉴定,M-IL-2(88Arg,125Ala)正确插入pPICZαA中,电转化后,重组载体通过同源重组整合到酵母基因组中,SDS-PAGE检测在26 ku左右有明显目的条带,与理论相符。经Western blot鉴定具有较高抗原性及特异性。BCA法测定甲醇诱导96 h融合蛋白表达量达315.2 mg/L。CCK-8法检测融合蛋白对人卵巢癌细胞SKOV3细胞及Hela细胞生长抑制作用,表明纯化的融合蛋白在体外能抑制人卵巢癌细胞SKOV3细胞及Hela细胞的生长增殖。该研究为融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)大规模制备和动物实验以及临床前期研究奠定了基础。     

HCMV感染对恶性胶质瘤U87细胞增殖及ATF5表达的影响

人巨细胞病毒(HCMV)能够诱导肿瘤细胞的恶性转化,但其分子机制尚有待进一步探索。探讨HCMV是否通过调控转录激活因子5(ATF5)的表达变化促进胶质瘤细胞的增殖。采用HCMV AD169株(MOI=5)感染神经胶质瘤U87细胞株,MTT方法观察HCMV感染0、12、24、48 h后细胞的增殖活性。Real-time PCR及Western-blot检测HCMV感染U87细胞后ATF5基因及蛋白的表达水平变化。以慢病毒为载体的靶向ATF5小干扰RNA构建载体,敲低ATF5表达水平后感染HCMV,MTT检测病毒感染细胞的增殖活性变化。HCMV感染神经胶质瘤U87细胞后,与未感染组比较,增值活性明显升高(P0.05),ATF5表达水平上升,表明HCMV感染使胶质瘤细胞增殖活性提高,细胞抗凋亡能力增强。成功构建沉默ATF5细胞系siATF5 U87,HCMV感染siATF5 U87细胞后使细胞增殖活性减弱,抗凋亡能力下降。以上实验结果表明,HCMV感染上调胶质瘤U87细胞ATF5的表达水平,促进细胞的增殖。因此HCMV感染可能通过调控ATF5信号通路增加细胞恶性性状,为治疗胶质瘤提供一个新的思路。     

HCMV基因在人和小鼠胚胎成纤维细胞中表达的差异性研究

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus, HCMV）种属特异性机制尚不清楚。研究通过检测HCMVADl69体外感染人胚胎成纤维细胞（Human embryo fibroblast, HEF）和小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryo fibroblast, MEF）后病毒基因的表达情况,探讨HCMV种属特异性的可能分子机制。首先用HCMV AD169（MOI=5）分别感染HEF和MEF,相差显微镜逐日观察细胞的形态学变化;RT—PCR检测HCMV即刻早期（IE1、IE2）、早期（uL84）和晚期基因（UL83）的表达情况;Western—blot和免疫荧光检测病毒基因编码蛋白表达的情况。形态学观察发现HEF感染HCMV后逐渐变大变圆并相互融合,第4天可见典型的HCMV特征性病变效应,而MEF则未出现上述的变化;RT-PCR和Western—blot表明HEF组表达即刻早期基因IE1和IE2、早期基因uL84和晚期基因UL83 mRNA以及各基因所编码的蛋白,且相对表达量显著高于模拟感染组（P〈0．01）;而MEF组仅IEl和IE2mRNA和蛋白相对表达量显著低于HEF组（P〈0．05）,而高于模拟感染组（P〈0．01）。免疫荧光检测发现HEF感染72h表达IE和UL83蛋白,而MEF则无明显表达。以上结果表明,HC—MV不能在MEF中复制并产生完整子代病毒颗粒,且病毒基因表达阻止在IE2基因表达之后和UL84基因表达之前,其种属特异性可能与即刻早期蛋白低水平的表达量有关。     

Nanog 基因在卵巢癌和卵巢肿瘤干细胞中的表达及意义

目的:探讨胚胎干细胞关键因子Nanog基因mRNA及其蛋白在卵巢癌和卵巢癌肿瘤干细胞中的表达及意义。方法:选取10例正常卵巢上皮组织、10例卵巢良性肿瘤及60例卵巢癌组织,采用逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)方法和免疫组织化学PV-6000两步法检测Nanog mRNA和蛋白表达水平;采用无血清悬浮培养法从SKOV-3卵巢癌细胞株中分离培养肿瘤干细胞,流式细胞术鉴定肿瘤干细胞CD117表达,采用RT-PCR和Western Blot方法检测SKOV-3卵巢癌细胞及肿瘤干细胞中NanogmRNA及其蛋白的表达水平。结果:Nanog mRNA在卵巢癌组织中的表达水平均高于正常卵巢组织和卵巢良性肿瘤组织(P<0.05);Nanog mRNA在不同分化程度及临床分期的卵巢癌组织中表达水平不同,低分化组高于高分化组(P<0.05);III-IV期高于I-II期(P<0.05);免疫组化结果同RT-PCR。从SKOV-3卵巢癌细胞株中成功分离出肿瘤干细胞,SKOV-3卵巢癌细胞和肿瘤干细胞Nanog mRNA相对含量分别为0.6044±0.0368,0.8736±0.0537,差异具有统计学意义(P<0.05),两种细胞Nanog蛋白相对含量分别为0.6364±0.0169 1.2788±0.0314,差别具有统计学意义(P<0.05)。结论:Nanog基因在卵巢癌组织和SKOV-3细胞系中均高表达,其在组织中的表达强度与临床分期及病理分级关系密切,且在肿瘤干细胞中表达高于一般卵巢癌细胞,其与卵巢癌的发生发展关系密切,可能是卵巢癌干细胞的表面标志物,有望成为新的标志物。     

HCMV感染对胶质瘤细胞U87自噬的影响

研究人巨细胞病毒(HCMV)感染对神经胶质瘤U87细胞自噬的影响。通过观察微管相关蛋白1轻链3(LC3)、自噬相关基因Beclin1及其蛋白表达的变化,从而探讨HCMV与神经胶质瘤发生、发展的关系及意义。用HCMV AD169(MOI=5)感染神经胶质瘤U87细胞,同时将未感染HCMV的U87细胞作为对照组。分别在6、12、24、48 h用RT-PCR检测Beclin1的表达,Western-blot和免疫荧光检测Beclin1和LC3编码蛋白的表达,最后用CCK-8检测细胞的增殖活性。结果显示,HCMV感染的U87细胞LC3-II蛋白表达水平逐渐下降(P<0.05);同时,HCMV感染的U87细胞Beclin1基因及蛋白的表达水平也逐渐下降(P<0.01),且HCMV感染U87细胞增殖显著(P<0.01)。以上结果表明,HCMV感染抑制胶质瘤U87细胞自噬,并会引起Beclin1表达水平下调,进而导致胶质瘤细胞增殖。     

EB病毒即刻早期BRLF1基因在淋巴瘤组织中多态性研究

目的：EB病毒（Epstein．Barrvirus,EBV）感染宿主细胞包括潜伏期和裂解期,它的即刻早期基因BRLFl编码产物Rta蛋白是EBV从潜伏期到裂解期的关键性调节因子。目前,Rta蛋白已成为治疗EBV相关肿瘤的靶蛋白,但有关BRLFl基因在EBV阳性淋巴瘤中的研究甚少,本研究旨在明确EB病毒即刻早期基因BRLFl在EB病毒阳性淋巴瘤组织中的变异规律,探讨其变异意义。方法：原位杂交筛选EB病毒阳性淋巴瘤（BL）,提取EB病毒DNA。PCR结合DNA测序检测EBV阳性淋巴瘤中BRLFl基因多态性,应用DNAStar软件对序列进行对比分析。结果：共筛选出27例EBV阳性淋巴瘤标本,在27例BL阳性标本中成功扩增BRLFl基因,与B95—8标准序列比对分析,共发现20处无义突变和19处有义突变。8例属于BR1-A亚型,18例属于BRl—C亚型,1例属于BRl-E亚型,其中以BRl-A亚型和BRl-C亚型最为常见,分别为29．6％（8／27）、66．7％（18／27）。与EBVaGC、NPC和1W相比,4种人群BRLFl亚型的分布不同,其中BRl-A亚型更多出现在健康人群中,BRl-C亚型更多出现在NPC和BL中。在Rta蛋白功能区中,二聚体区域呈高度保守,在DNA结合区域和反式激活区域均检测出序列突变,16种CTL抗原表位中,只有NAA、QKE和ERP表位发生改变,且NAA和QKE在健康人群中突变率较高。结论：山东地区EB病毒阳性淋巴瘤BRLFl基因变异类型主要为BRl-A亚型和BRl-C亚型。BRl-C亚型可能与BL相关,发生在Rta蛋白DNA结合区域和反式激活区域的突变可能对其功能产生影响,多数CTL表位序列保守提示BRLFl可以用作EBV相关淋巴瘤免疫治疗的靶基因。     

神经胶质瘤细胞ATF5表达水平对HCMV复制的影响

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)在神经胶质瘤细胞中的复制水平不一,其机制尚不清楚。本研究通过下调转录激活因子5(ATF5)在神经胶质瘤细胞中的表达,检测HCMV感染神经胶质瘤细胞后病毒复制水平的变化。首先用HCMV AD169(MOI=5)分别感染U87、SY5Y及A172细胞,观察细胞形态变化,分别在24、48、72、96、120 h取各时间点上清液检测病毒滴度;Real-time PCR检测HCMV即刻早期基因(IE2)、早期基因(UL44)、晚期基因(UL99)及ATF5的表达情况;Western-blot检测病毒基因编码蛋白及ATF5表达的情况。结果显示HCMV在U87、SY5Y细胞中复制水平与病毒在A172细胞中复制水平相比,U87、SY5Y细胞组明显高于A172细胞组(P0.05),ATF5表达在U87、SY5Y细胞组与A172细胞组相比,U87、SY5Y细胞组ATF5表达明显高于A172组(P0.05);利用慢病毒介导的RNA干扰技术下调ATF5在U87、SY5Y细胞的表达,用HCMV感染细胞检测病毒基因及蛋白的表达,结果ATF5表达下调可抑制HCMV的复制(P0.05)。以上结果表明,在胶质瘤细胞中下调ATF5表达水平可以抑制HCMV的复制水平。