自体ADSCs复合PRF修复家兔耳软骨缺损的实验研究

目的:将未诱导的自体脂肪干细胞(ADSCs)与富血小板纤维蛋白(PRF)复合,作为一种全新的软骨修复材料,探讨其对家兔耳软骨全层缺损修复的可行性.方法:取家兔10只,于每只家兔耳部做4处软骨全层缺损,随机分为A、B、C、D组,A组,作为空白对照;B组植入自体ADSCs;C组植入自体PRF;D组植入自体ADSCs与PRF的复合物.分别于术后1月、2月、3月取材,进行大体及HE染色观察,并使用IPP6.0软件对软骨生成量进行半定量分析.结果:HE染色显示,3月后,A组几乎无新生软骨生成,B、C、D三组软骨生成量依次增多,D组尤为明显.IPP6.0统计结果显示,移植物植入3月后,A组软骨缺损修复率为(1.68±0.17)％,B组为(15.4±0.91.)％,C组为(32.0±2.76)％,D组为(85.77±4.88)％.各组间有显著统计学差异,与HE染色结果相符.结论:未诱导的自体ADSC s复合自体PRF作为一种全新的软骨修复材料,可以有效的修复家兔耳软骨全层缺损,具有潜在的临床应用价值.     

体外培养小鼠下颌下腺细胞生长特性的实验研究

目的：研究小鼠下颌下腺细胞的培养方法,探讨下颌下腺细胞培养条件及细胞生长特性,为研究干细胞转分化涎腺腺泡细胞以及涎腺再生研究奠定理论基础和技术支持。方法：取2周龄的小鼠,组织块法和消化法分别进行培养,用活细胞观察法和HE染色法记录细胞形态学特征;免疫荧光染色法鉴定;通过生长曲线和细胞倍增时间来比较两种方法对细胞增殖能力的影响。结果：组织块法和消化法均可以成功的培养下颌下腺细胞,（1）组织块法培养的细胞呈卵圆形或多边形,10天左右成铺路石样;消化法培养细胞亦为上皮样细胞,呈多边形,胞质丰富;（2）HE染色下颌下腺细胞呈多边形,胞核明显;（3）Cytokeratin13和AQP5表达阳性,Wimentin表达阴性;（4）组织块法培养细胞增殖相对较平缓,消化法培养细胞增长较迅速;（5）消化法培养倍增时间（1．3471±0．6071）天比组织块法倍增时间（2．1887±1．1503）明显缩短（P〈0．05）;结论：体外可以成功的培养下颌下腺细胞,但是同时证明下颌下腺细胞长期传代较困难,这为研究干细胞转分化涎腺细胞和涎腺再生体内实验提供了理论和实验基础。     

应用微重力旋转生物反应器培养小鼠脂肪干细胞的初步实验研究

目的:观察微重力旋转培养系统(Rotary Cell Culture System,RCCS),对小鼠脂肪干细胞增殖的影响,以寻求一种更有效的促进干细胞扩增的方法.方法:从小鼠的脂肪组织中提取分离、培养脂肪干细胞(ADSCs),并对脂肪干细胞进行流式鉴定后,利用活细胞观察法、Dil免疫荧光标记法、扫描电镜法观察微重力旋转三维培养系统对脂肪干细胞增殖的影响;通过与平面二维培养作对比,血小板计数法记录细胞的增殖情况,并绘制生长曲线.结果:两组的细胞倍增时间具有统计学意义(P＜0.05),模拟微重力旋转三维培养系统较传统平面二维培养系统,脂肪干细胞增殖更明显,生长速度更快.结论:模拟微重力旋转三维培养系统更有利于脂肪干细胞的增殖生长,为后期利用脂肪干细胞修复受损涎腺提供一种更快捷有效的扩增方法.     

小鼠脂肪来源干细胞体外培养、诱导分化及鉴定

目的:观察C57小鼠ASCs (Adipose-derived stem cells,ASCs)体外培养的生物学特性,探讨其成脂成骨诱导分化能力.方法:无菌条件下切取C57小鼠腹股沟处脂肪组织,0.25％Ⅰ型胶原酶消化,分离培养ASCs,37℃,5％CO2饱和湿度孵箱培养,细胞融合达80％时消化传代.观察其细胞形态;MTT比色法测细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞表面标志物;取第2代细胞行成骨及成脂诱导培养,3周后分别茜素红染色和油红O染色鉴定.结果:从C57小鼠脂肪组织中分离获取的ASCs呈长梭形,成纤维细胞样.细胞生长曲线呈“S”型,证明ASCs具有很强的增殖能力;流式细胞术分析结果:CD29、CD44、CD90阳性表达,CD31、CD34、CD45阴性表达;成骨诱导后茜素红染色阳性,成脂诱导后油红O染色阳性.结论:本试验分离培养的细胞为ASCs,具有确切分化能力.     

应用便携式数字化温控烫伤仪建立标准化大鼠皮肤烫伤模型

目的:研制一种新型便携式数字化温控烫伤仪,通过自制数字化烫伤仪对大鼠进行烫伤实验,建立标准化大鼠皮肤烫伤模型,从而验证数字化烫伤仪的有效及实用性。方法:选取18只SD大鼠分为对照组(3只,不烫伤);实验组(15只),再将实验组大鼠随机分配为A组(6只)、B组(6只)、C组(3只),选取大鼠背部作为烫伤实验部位:1、时间设定为20 s和30 s,烫伤仪温度分别设定为70℃、80℃、90℃、100℃、120℃,对A组和B组大鼠进行烫伤处理。2、温度设定为100℃,烫伤仪加热时间分别设定为10 s、15 s、25 s,对C组大鼠进行烫伤处理。烫伤后48 h切取实验组和对照组大鼠背部皮肤,进行大体及显微镜下组织病理学观察。结果:70℃20s烫伤点为I°烫伤;70℃30 s、80℃20 s、100℃10 s烫伤点为浅Ⅱ°烫伤;80℃30 s和100℃15 s烫伤点为深Ⅱ°烫伤;90℃20 s、90℃30 s、100℃20 s烫伤点为Ⅲ°烫伤;100℃25 s、100℃30 s、120℃20 s、120℃30 s烫伤点为IV°烫伤。结论:新型便携式数字化温控烫伤仪,可以可靠的建立标准化大鼠皮肤烫伤模型。     

骨质疏松兔松质骨微观结构和微观成分的时间序贯性变化

目的:研究去势手术建立骨质疏松兔模型中松质骨微观结构和微观成分的时间序贯性变化。方法:40只新西兰白兔随机分为假手术组(sham组,n=20)和骨质疏松组(OP组,n=20)。OP组兔子给予去势手术处理,sham组给予假手术处理。分别于术后的0周、4周、6周、8周,利用DXA测量腰椎骨密度(每组每个时间点选择5只动物)。之后处死动物,采集腰椎标本。利用Micro-CT、FTIR、腰椎轴向压缩试验得到松质骨的微观结构、微观成分(骨矿盐晶体和胶原)和宏观力学参数。利用t检验比较同一时间点两组之间的相关参数。结果:OP组BMD逐渐下降,松质骨微观结构逐渐疏松,微观组成属性逐渐改变,宏观力学强度均逐渐下降。FTIR在4周时即检测到OP组腰椎骨矿盐和胶原基质比(P=0.046)、骨矿盐结晶度(P=0.018)、胶原交联比(P=0.006)发生显著性改变,早于BMD和微观结构的变化。OP组腰椎宏观生物力学强度在第8周时达到最低点(P=0.001)。结论:去势手术后,腰椎松质骨骨矿盐晶体和胶原属性最早发生变化,松质骨微观成分和微观结构的改变是导致椎体强度明显改变的原因。FTIR技术可以较早的检测到骨质疏松发生过程中骨组织微观成分的改变。     

非诱导脂肪干细胞膜片复合PRF修复兔髁状突软骨缺损

目的:探索非诱导ADSCs膜片/PRF复合植入物修复兔子下颌骨髁状突软骨缺损的可行性及效果。方法:选取36只3月龄新西兰雄性大白兔,随机分为3个组即ADSCs膜片/PRF组、PRF组、空白对照组,在3%戊巴比妥钠麻醉下解剖暴露出髁状突关节面并用裂钻分别在双侧髁状突软骨面上制备一3 mm直径、3 mm深的髁突表面软骨缺损区,按实验设计每个分组分别填入相应的植入物。分别在术后4周、8周、12周处死相应时间点的动物采集髁突标本,标本进行大体及组织学检查比较。结果:术后12周时空白对照组的下颌髁状突软骨缺损未能修复,PRF组有少量不规则、不连续的软骨形成,ADSCs膜片/PRF组的修复效果较好,表面软骨接近正常纤维软骨,与周围软骨连续性较好。组织学染色也显示ADSCs膜片/PRF组优于PRF组和空白对照组。结论:证明了ADSCs膜片/PRF复合物修复髁状突软骨缺损的可行性。     

幼龄犬髁突囊外损伤对髁突及下颌骨生长发育的影响

目的:研究幼龄犬髁突不同形式的囊外损伤对髁突局部及下颌骨生长发育的影响。方法:20只6月龄中华田园犬随机分为五组,除空白对照组外,分别建立幼龄犬单侧髁突颈部骨折、髁突颈部骨折后内固定、髁突颈部骨膜损伤及髁突颈部骨皮质损伤四种动物模型,饲养12w及24w后通过头颅CT三维重建测量的方法观察其对下颌骨对称性及生长量的影响,并通过组织学染色观察髁突局部生长中心的微观改变。结果:1仅单侧髁突颈部骨折组在损伤早期对下颌骨及髁突发育产生了影响,使损伤侧髁突颈部形态变短变粗,下颌骨长度也较对侧减小,但髁突及颈部的局部适应性改建会逐渐抵消这些影响,24w时下颌骨已不存在骨性不对称,但功能性原因仍能导致颏点出现向患侧的偏斜。2其余三种损伤形式在实验设定的观察期内对髁突及下颌骨的生长发育影响不大,但单侧髁突颈部骨折后内固定组在24w时也出现了下颌骨的功能性偏斜。3各种损伤形式对髁突及下颌骨生长发育的远期影响有待进一步实验证实。结论:生长发育期犬髁突囊外损伤对髁突及下颌骨生长发育的影响不大。     

体外诱导小鼠脂肪来源干细胞向内皮细胞分化的实验研究

目的：探索体外小鼠脂肪来源干细胞（Adipose—derivedstemcells,ASCs）诱导分化为内皮细胞（endothelialprogenitorcells,EPCs）的可行性。方法：利用I型胶原酶消化法和传代培养纯化法从小鼠脂肪组织中分离、培养及扩增ASCs,通过流式细胞仪检测ASCs特异性表面抗原CD29和CD44、CD105的表达;取第2代ASCs进行内皮诱导：即BD基质胶包被＋内皮细胞生长诱导培养基（M199＋10％血清＋10ng／mL血管内皮细胞生长因子VEGF＋10ng／ml碱性生长因子bFGF）。诱导两周左右,倒置显微镜观察诱导前后细胞的一般形态学特征;同时通过成血管实验观察成管腔能力;通过免疫荧光鉴定CD31表型分子的表达。结果：成功培养小鼠ASCs;CD29、CD44、CD90、呈阳性表达,而CD31、CD34、CD45呈阴性表达;诱导后的细胞形态呈三角形或多边形;HE染色观察可见明显的管腔样结构;免疫荧光法CD31表达阳性;MTT法成功记录EPCs增殖生长曲线。结论：成功的诱导小鼠脂肪来源干细胞分化为血管内皮细胞,为后续体内移植实验提供理论基础,同时也为临床受损组织或器官的重建再生提供实验基础。     

兔骨髓干细胞和脂肪干细胞增殖和分化能力的比较

目的:评价两种不同来源的间充质干细胞,即骨髓干细胞(BMSC)和脂肪干细胞(ADSC)增殖和分化能力,为其将来更好的应用于细胞治疗和组织工程提供一定的理论支持和依据.方法:分别取同一只兔的髂骨骨髓和其腹股沟脂肪作为BMSC和ADSC的来源,分离培养后比较其生物学特性包括细胞的增殖能力(MTT),成骨成脂分化潜能,细胞表面抗原标记物.结果:BMSC类似纤维细胞样,呈长梭形紧密排列;而ADSC细胞整体呈旋涡状排列;但ADSC倍增时间更短,增殖速度更快;两者都具有向成骨成脂分化的潜能,但BMSC的成骨能力更好.结论:ADSC有更短地倍增时间和更快地增殖速度;两者都具有向成骨成脂分化的潜能,但相较于ADSC更强的成脂分化能力,BMSC的成骨分化能力更好.两者都可以作为组织工程的种子细胞.