兔异体脂肪干细胞移植的实验研究

目的:建立一种可注射异体脂肪移植模型,观察兔异体脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)复合自体脂肪颗粒(adipose granule,AG)和富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)移植后的形态学和免疫学的变化,为临床异体脂肪干细胞移植提供一种实验依据.方法:取30只健康新西兰家兔,随机分成5组:A组,(N=6),移植物为自体AG;B组,(N=6),自体AG+自体PRF;C组(N=6),自体AG+自体ADSCs:D组(N=6),自体AGr自体PRF+自体ADSCs,E组(N＝6),实验组,自体AG+自体PRF+异体ADSCs.在术后1、3、6个月,大体外观、HE染色分析其形态学改变;免疫组化、外周血淋巴细胞亚群CD4/CD8比值、血浆IL2和IL4分析其免疫学改变.结果:术后l、3、6个月在大体外观、免疫组化等D、E两组与A、B、C三组比较均有显著性差异(P＜0.05).E组在淋巴亚群CD4/CD8、血浆IL-2、IL-4等与D组比较均无显著性差异(P＞0.05).结论:异体ADSCs复合自体PRF、AG能够显著提高移植脂肪组织的成活率,并且无明显免疫排斥反应,可为临床异体脂肪干细胞移植提供实验依据.     

非诱导脂肪干细胞膜片复合PRF修复兔髁状突软骨缺损

目的:探索非诱导ADSCs膜片/PRF复合植入物修复兔子下颌骨髁状突软骨缺损的可行性及效果。方法:选取36只3月龄新西兰雄性大白兔,随机分为3个组即ADSCs膜片/PRF组、PRF组、空白对照组,在3%戊巴比妥钠麻醉下解剖暴露出髁状突关节面并用裂钻分别在双侧髁状突软骨面上制备一3 mm直径、3 mm深的髁突表面软骨缺损区,按实验设计每个分组分别填入相应的植入物。分别在术后4周、8周、12周处死相应时间点的动物采集髁突标本,标本进行大体及组织学检查比较。结果:术后12周时空白对照组的下颌髁状突软骨缺损未能修复,PRF组有少量不规则、不连续的软骨形成,ADSCs膜片/PRF组的修复效果较好,表面软骨接近正常纤维软骨,与周围软骨连续性较好。组织学染色也显示ADSCs膜片/PRF组优于PRF组和空白对照组。结论:证明了ADSCs膜片/PRF复合物修复髁状突软骨缺损的可行性。     

自体软骨细胞修复兔膝关节全层软骨缺损的实验研究

目的：研究自体软骨细胞复合于人脐带Wharton胶支架对兔膝关节全层软骨缺损的修复效果。方法：经自体关节软骨细胞 经体外培养后复合到制备人脐带Wharton 胶取向支架内构建细胞- 支架复合体,选取健康清洁新西兰兔23 只,雌雄不拘,体重 2.5-3.0 kg,取滑车沟中下部制作全层软骨缺损模型后随机分成A、B和C 组。A组(n= 10)：植入自体软骨细胞+人脐带Wharton 胶取向支架复合体;B组(n= 10)：植入单纯人脐带Wharton 胶取向支架;C组(n= 3)：不做任何处理正常兔。分别于术后3 个月和6 个月各处死后取材进行生物力学特性评估检测。结果：压痕实验显示在3 个月时A 和B 组修复区组织刚度分别达到正常软骨的 45.72%和25.25%,且A组刚度明显优于B组,均低于C组( P<0.05);到6 个月时各自达到正常软骨刚度的69.76%和35.14%,同 样A 组刚度明显优于B 组,均低于C 组( P<0.05)且在同期个各组之间均有显著性差异（F=80.309,P<0.05）。结论：体外培养的自 体软骨细胞与人脐带Wharton 胶复合在体内的微环境作用下修复软骨缺损效果良好,为软骨组织工程提供了一种新支架材料。     

骨碎补结合组织工程软骨促进软骨再生的实验研究

目的:评估骨碎补结合组织工程软骨治疗对实验兔软骨缺陷模型软骨再生的疗效。方法:将h IGF-1基因转染MSCs,并与脱细胞真皮基质(ADM)构建组织工程软骨。24只新西兰白兔随机分为A、B、C、D四组,A、C组进行自体软骨移植,B、D组进行改建的细胞-ADM移植。C、D组用40%骨碎补汤喂养4周,150 m L/d。第12周处死实验动物,分离缺损关节软骨部位,蜡块包埋染色,通过总体形态评价软骨再生组织。采用组织学评分评估再生软骨质量。采用甲苯胺蓝染色评价缺损部位产生软骨糖胺聚糖的情况。结果:与B组比较,C组和D组的新生软骨覆盖度、新骨髓的颜色、缺损边缘和表面粗糙度均显著提高(P0.05);再生软骨的组织学评分软骨表面评分显著改善(P0.05)。C组与D组具有比其他组更好的基质、细胞分布和表面指数。并且有较厚的透明样软骨组织,具有正常的糖胺聚糖产生。表明该治疗方法可以通过再生透明样软骨且没有不良事件来减少软骨缺陷。结论:工程软骨结合骨碎补治疗可显著改善兔膝关节软骨缺损修复的质量,为临床治疗软骨病变提供重要理论依据。     

脱细胞羊膜与小肠黏膜下层促进大鼠皮肤缺损修复和血管形成

目的观察脱细胞羊膜(HAM)与小肠黏膜下层(SIS)促进大鼠皮肤缺损修复和血管形成的作用。方法SD大鼠24只,在两侧背部各做1个直径为1.8cm圆形全层皮肤缺损。创面随机分为A组、B组和C组。A组HAM覆盖,B组SIS覆盖,C组纱布覆盖。在2周时处死动物取材,HE染色观察皮肤缺损修复情况。免疫组织化学染色检测K19和VEGF,RT-PCR检测VEGF mRNA的表达。结果A组、B组愈合较好。C组愈合较差。免疫组织化学染色显示,A、B组K19、VEGF阳性细胞显著多于C组,其中A组最多;RT-PCR结果显示,A、B组比C组表达更多的VEGF mRNA其中A组最多,差异显著,有统计学意义(P<0.05)。结论HAM和SIS均能增加皮肤创面组织中K19阳性细胞数,上调VEGF mRNA的表达、增加VEGF的分泌,其中HAM具有更强的促进皮肤缺损修复和血管形成作用。     

TGF-β3与TIMP-2联合转染兔骨髓间充质干细胞复合丝素蛋白/壳聚糖生物支架修复兔软骨缺损(英文)

目的:TGF-β3广泛存在于骨组织、软骨组织中,能诱导体外培养的间充质干细胞向软骨分化、生长。TIMP-2能抑制MMP对软骨基质的降解,保护新生软骨组织。本实验探讨单纯TGF-β3和TGF-β3,TIMP-2联合转染兔骨髓间充质干细胞复合丝素蛋白壳聚糖/(silk fibrin/chitosan,SF/CS)生物支架植入动物体内修复兔膝关节软骨缺损的可行性及效果差异。方法:将新西兰大白兔20只分为4组,每组5只(支架组、未转染组、reAAV-TGF-β3转染组、reAAV-TGF-β3,reAAV-TIMP-2联合转染组)。在无菌条件下取兔第三代对数生长期骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),用携带目的基因的重组腺相关病毒进行转染,将转染成功的BMSCs与SF-CS生物支架复合,分别植入兔膝关节软骨缺损处:未转染组植入SF-CS生物支架,未转染组植入未转染的BMSCs复合SF-CS生物支架,reAAV-TGF-β3转染组植入reAAV-TGF-β3转染的BMSCs复合SF-CS生物支架,reAAV-TGF-β3,TIMP-2联合转染组植入reAAV-TGF-β3,TIMP-2联合转染的BMSCs复合SF-CS生物支架。两月后处死家兔,肉眼观察以及HE染色评定缺损软骨修复情况。并进行软骨细胞特征性染色即甲苯胺蓝染色及II型胶原免疫组化染色鉴定。结果:两个月后除支架组外各实验组兔膝关节软骨缺损处均有软骨样物质形成,且联合转染组诱导的新生成分更接近缺损处周围正常软骨。联合转染组与reAAV-TGF-β3转染组;联合转染组与未转染组;reAAV-TGF-β3转染组与未转染组的评分差异均具有统计学意义(P0.05)。HE染色结果提示联合转染组软骨修复效果较单纯TGF-β3转染组更好。结论:单纯TGF-β3转染兔骨髓间充质干细胞对兔膝关节软骨缺损有修复作用,TGF-β3与TIMP-2联合转染组修复缺损效果更明显,提示TIMP-2与TGF-β3具有协同效应。     

软骨细胞联合BMP/bFGF移植对关节软骨损伤的修复作用

目的：探讨同种异体软骨细胞移植联合骨形态发生蛋白（BMP）/碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对关节软骨损伤的修复作用。方法：取24只14周龄成年大白兔,随机分为A、B、C、D组,每组6只,于双侧膝关节软骨处制作软骨缺损模型,A组采用软骨细胞移植联合应用BMP/bFGF处理,B组采用单纯软骨细胞移植,C组采用单纯BMP/bFGF修复,D组采用磷酸盐缓冲液（PBS）作为阴性对照,于处理后8、12、24周行形态学、电镜观察及组织学评分。结果：8周时,A组关节修复面与周围结合紧密,可见大量软骨细胞出现,电镜下有软骨基质形成;B、C组仅有少量软骨细胞;D组未见修复。12周时,A组关节修复面与周围组织界限模糊,软骨细胞增殖活跃,电镜下可见成熟软骨基质;B、C组修复块周围有肉芽组织生成,电镜下可见未成熟的软骨基质出现;D组可见肉芽组织形成。24周时,A组修复面周围组织融合,电镜下软骨细胞纵行排列;B、C组关节面修复不完全,电镜下软骨细胞分布不均;D组见大量肉芽组织形成。24周时,A组组织学评分（1.87±0.65）,明显低于B组（3.49±0.71）、C组（3.43±0.83）组和D组（13.45±0.97）,差异均有统计学意义（P〈0.05）,B、C组均明显低于D组,差异有统计学意义（P〈0.05）,B、C组之间比较无明显差异。结论：软骨细胞联合BMP/bFGF移植能够促进软骨生长,提高软骨损伤的修复质量。     

骨碎补结合组织工程软骨促进软骨再生及其机理研究

目的:评估骨碎补在促进软骨再生治疗中的价值及作用机制。方法:选取健康新西兰大耳白兔100只,采用随机数值表法随机分为5组,每组包含20只实验动物。A、B组:改建后进行肾上腺髓质素(adrenomedullin,ADM)移植;C组:自体骨髓充质干细胞(MSCs)复合,并进行改建ADM移植;D、E组:进行h IGF-1基因转染的MSCs复合,并改建ADM移植。B、C、E组实验动物结合喂养40%骨碎补汤,每只每日150ml,用药4周。A、D组不结合使用口服骨碎补汤。每组均在第4、8、12w时处死5只实验动物,切取关节软骨缺损部位并进行组织学观察,采用Masson三色染色法评估软骨细胞的形态变化,采用Wakitani组织学评分进行各组间形态学比较。结果:E组实验动物关节软骨的表面有比较完整的潮线,大部分比较光滑,变薄区可见零散的浅淡着色的纤维组织。在第4、8、12周,各组Wakitani组织学评分逐渐下降,但结合骨碎补的B、C、E三组下降更为显著(P0.05),说明骨碎补可显著改善软骨组织缺损。结论:采用中药骨碎补结合工程软骨可以显著提高家兔膝关节软骨缺损修复的质量,为临床使用骨碎补治疗软骨病变提供了重要的依据。     

巴戟天水提液有效萃取成分促进微波致雄性大鼠生殖损伤的修复

目的探讨巴戟天(Morinda officinalis F.C.How)水提液对微波辐射致生殖系统损伤的修复作用。方法以900MHz频率、218μm/cm2辐射密度的低功率微波持续辐射10天,建立雄性SD大鼠生殖损伤模型。66只健康成年雄性SD大鼠随机分为11组。A组为空白对照组,B组为辐射未给药组,C组为辐射+生理盐水组,D组为巴戟天水提液乙酸乙酯萃取水层治疗组,E组为巴戟天水提液乙酸乙酯萃取酯层治疗组(其中D、E组各有10g、20g、30g、40g生药量/kg浓度梯度组)。每天灌胃1.5ml,持续14d。观察大鼠性行为学指标差异,同时检测血清睾酮变化;比较睾丸、附睾指数以及睾丸组织形态学的改变。结果巴戟天水提液乙酸乙酯萃取各层浓度梯度组分别给药后,D3、D4组扑捉潜伏期与B、C组相比缩短,D4组扑捉次数较之B、C组增加,余治疗组性行为学指标与B、C组无明显差别。D3、D4组睾酮水平较之B、C组均显著升高。HE染色和PCNA/SCP3双重免疫荧光染色显示,随着给药剂量增大,D组大鼠生精细胞数量逐渐增多,以A型精原细胞和粗线期初级精母细胞修复最为明显。结论巴戟天水提液乙酸乙酯萃取水层可改善大鼠性欲、修复生精上皮生精细胞和精子生成,最佳治疗剂量为40g/kg,其机制可能与促进睾酮分泌增加有关。     

rhBMP-2 诱导异位软骨修复重建兔气管缺损的实验研究

目的:探讨重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)作为激活物诱导异位软骨修复并重建兔气管缺损的可行性。方法:取24只新西兰大白兔,制备气管前壁软骨1/3缺损模型。随机分为A、B组,每组12只,A组为实验组,在气管缺损处前壁颈前肌肉修补,多点注射rhBMP-2;B组于气管软骨缺损部位直接颈前肌群修补。术后观察动物一般情况,于4、8、12周取材进行大体观察、HE染色观察重建区域情况。结果:术后A组动物均存活至实验完成,B组因气道感染及气道分泌物堵管潴留致使实验兔死亡,其余动物出现皮下气肿,呼吸不畅等情况。组织学观察A组有明显的新生软骨细胞及少量软骨样组织,可见结缔组织包绕,周围肌肉组织完整,排列整齐,未见明显坏死组织,有少量淋巴细胞浸润。B组未见软骨组织生成,可见大量肉芽组织增生,结缔组织排列紊乱,伴少量坏死组织,大量淋巴浸润。结论:rhBMP-2可通过注射到颈前肌肉修补肌群中诱导软骨细胞和软骨样组织生成,减轻炎症反应,联合颈前肌瓣修复重建气管缺损能充分维持修复重建后的气道形态,具有减少术后皮下气肿、气管狭窄的作用,有望用于临床修复重建气管组织缺损。