表达HSV－2 gD基因的重组痘苗病毒保护小鼠对抗致死量HSV病霉攻击

利用ＰＣＲ方法对单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白Ｄ（ＨＳＶ－２ｇＤ）基因进行了修饰,在其５＇端删去约５００ｂｐ的非编码区,仅保留ＡＴＧ上游７个ｂｐ。将修饰后的ＨＳＶ－２ｇＤ基因插入到带有痘苗病毒天坛株ＴＫ基因区段的痘苗表达质粒ｐＪＳＡ１１７５,置于痘苗病毒Ｐ７．５ｋ早／晚期启动子控制下。将此重组质粒用脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法转染已受野型ＴＫ￣＋痘苗病毒天坛株感染的ＴＫ￣－１４３细胞,通过同源重组机制和标志基因ＬａｃＺ产物的蓝斑显色作用,以及ＢｕｄＲ试剂对ＴＫ表型的选择压力,筛选出整合有ＨＳＶ－２ｇＤ基因的重组痘苗病毒。Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交表明,ＨＳＶ－２ｇＤ基因已正确地插入痘苗病毒ＴＫ基因区内;间接免疫荧光检测显示,ＨＳＶ－２ｇＤ蛋白已得到有效表达,且主要分布于细胞膜。重组病毒免疫家兔可产生明显的抗ＨＳＶ－２ｇＤ中和抗体。用重组病毒免疫小鼠,３周后可使９４％（１７／１８）的小鼠对抗ＨＳＶ－２的致死量攻击,表明重组病毒具有明显的免疫保护作用。     

丙型肝炎病毒的基因克隆

丙型肝炎病毒(HCV)在患者血液中含量极微,难以直接找到病毒本身。为确立特异拘诊断方法,经历了漫长的岁月,多年来一直是沿用除外诊断法。     

超正电荷绿荧光蛋白+36GFP作为核酸载体的细胞穿透性分析

旨在通过原核表达纯化超正电荷绿色荧光蛋白+36GFP,研究其与核酸的结合作用及作为核酸载体的细胞转导功能。将pET+36GFP-HA2质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,然后表达纯化+36GFP蛋白。将得到的目的蛋白在特定浓度下分别转导293细胞、HepG2细胞、A549细胞和B16细胞,流式细胞仪检测+36GFP的转导效率;+36GFP蛋白(100 nmol/L)转导A549细胞,激光共聚焦显微镜观察结果;将+36GFP蛋白与质粒DNA按不同比例孵育,凝胶阻滞实验检测+36GFP与DNA的结合能力;激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测+36GFP蛋白携带质粒DNA转导细胞后报告基因的表达。结果显示,+36GFP蛋白具有较高的细胞转导效率,且随浓度升高转导效率增加,呈浓度依赖性。凝胶阻滞实验显示,+36GFP能够与质粒DNA结合,阻滞DNA在凝胶中迁移,且呈现一定的浓度依赖性。+36GFP包裹质粒转导细胞后,可高效携带质粒DNA转导进入细胞,使质粒报告基因得到表达。本研究成功表达纯化了+36GFP蛋白,证实该蛋白具有较高的细胞转导效率,可将外源核酸携带入细胞使外源基因得到表达。     

腺病毒E4orf4蛋白诱导肿瘤特异性细胞死亡及其在癌症治疗中的应用

腺病毒E4orf4蛋白由腺病毒早期第4转录区第4开放读码框编码,为一种多功能调节蛋白质,其活性包括下调早期病毒基因表达和下调影响病毒复制的细胞基因表达,调控病毒基因的选择性转录后剪切以影响病毒感染进程等。当E4orf4脱离病毒环境单独表达时,可诱导不依赖p53和胱天蛋白酶途径的癌细胞特异性细胞死亡,而不影响原代细胞的正常生长。这表明E4orf4对癌细胞有特异性的杀伤作用。本文主要介绍了：（1）E4orf4主要蛋白质伴侣（蛋白磷酸酶2A和Src家族激酶）对E4orf4细胞杀伤作用的贡献;（2）E4orf4诱导的细胞死亡独特模式的基本机制及其特点;（3）近年来利用E4orf4治疗癌症的研究。     

TAT细胞穿透肽融合小鼠SurvivinT34A重组蛋白的原核表达纯化及其细胞转导效能研究

为研究细胞穿透肽TAT融合小鼠存活素T34A(survivinT34A)重组蛋白(TAT-msvT34A)转导细胞的效能,该实验将表达TAT-msvT34A的原核表达载体pTAT-msvT34A转化大肠杆菌表达株E.coli BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在。通过亲和层析、离子交换柱层析、分子筛等步骤纯化,得到TAT-msvT34A融合蛋白的纯度可达98%。纯化的融合蛋白用异硫氰酸荧光素(FITC)标记(FITC-TAT-msvT34A)后,分别转导HepG2、TC-1、B16及HEK293细胞株,流式细胞仪检测显示,较低浓度的重组蛋白即对HepG2、TC-1、B16及HEK293等细胞株具有较高的转导效能,在100 nmol/L时的转导效率均可达到60%以上,作为对照,FITC标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)在100 nmol/L时对上述细胞株的转导效率极低,结果具有显著性差异(P<0.01)。荧光显微镜观察可见,50 nmol/L和100 nmol/L的TAT-msvT34A融合蛋白对HepG2细胞的转导效率均可达50%,而对照FITC-BS...     

癌胚抗原单链抗体在细菌表面的展示及其应用

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)作为肿瘤标志物,在临床肿瘤诊断及肿瘤靶向治疗等方面具有重要应用价值。癌胚抗原单链抗体（CEA-specific single chain antibody fragments , CEA-scFv）能够特异性结合癌胚抗原。本研究将癌胚抗原单链抗体展示于大肠杆菌细胞表面,分析其作为癌胚抗原检测平台和细菌靶向载体的可行性。首先将CEA-scFv基因克隆到表面展示载体pBAD-OmpA-mCherry 中,经酶切和测序证实,成功构建了重组质粒pBAD-OmpA-mCherry-CEA。重组菌经阿拉伯糖诱导后可检测到红色荧光,荧光强度在胰酶的作用下降低,全菌ELISA检测呈阳性反应,提示融合蛋白和目的蛋白质在重组菌表面展示成功。由Western印迹分析可知,融合蛋白的相对分子质量约为85 kD,符合预期设计。进一步的研究提示,重组菌在大肠杆菌表面展示的癌胚抗原单链抗体具有生物活性,能够有效结合A549细胞裂解液的癌胚抗原。在细菌侵染细胞实验中,与对照组相比,重组菌孵育A549细胞后细胞内可明显观察到点状红色荧光,证明重组菌能够靶向侵入癌胚抗原阳性肿瘤细胞。本研究为癌胚抗原相关的快速诊断和基于细菌载体的肿瘤靶向治疗奠定了实验基础。     

单纯疱疹病毒潜伏感染和作为基因工程载体的应用

近年关于单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）潜伏的分子机理研究取得重大突破。虽然ＨＳＶ能够形成潜伏感染的特性给防治造成棘手的难题,然而利用这一特性动为将ＨＳＶ改造成基因工程载体提供了可能,ＨＳＶ载体的开发将为基因治疗和神经科学等展现广阔的应用前景,这方面初步应用已有一良好开端,但在评价其未来活体内应用潜力时,还有一些重要问题必需阐明。     

适配体与病毒性感染诊断及治疗

适配体（Aptamers）是通过指数富集的配体系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）技术,从随机核酸文库中筛选出来的单链寡核苷酸,已在临床医疗及其他领域得到日益广泛的应用.与抗体相比,适配体具有很多优点,如高亲和力、高特异性、分子量小、几乎无免疫排斥反应、结构稳定、易于合成等.可用于适配体筛选的靶标范围非常广,包括有机小分子、蛋白、完整细胞及病毒颗粒等.迅速可靠的病原检测对于病毒性传染病的成功预防和治疗具有重要意义.随着严格筛选和快速分离技术的进步,适配体在病毒感染的检测治疗中显示出巨大的潜力.本文概括介绍了适配体在病毒研究方面的最新应用进展及未来前景.