凋亡素蛋白多克隆抗体的制备及免疫学评价

凋亡素由鸡贫血病毒中的VP3基因编码,能诱导多种肿瘤细胞发生凋亡。以真核表达载体pcDNA3.0-VP3为模板构建原核表达载体pET8a-VP3,经NdeⅠ/BamHⅠ双酶切鉴定和基因测序无误后,在IPGT诱导下表达VP3蛋白并对其进行纯化,将纯化后的VP3蛋白与弗氏完全佐剂或不完全佐剂乳化后,分别对两只新西兰大耳白兔进行皮下多点注射,间接ELISA检测免疫后血清效价,效价达到指标后第2天以心脏穿刺的方法采全血后分离抗血清。抗血清效价高的兔子进一步采用Protein A纯化总IgG,最终纯化后的抗体效价可以达到1 ∶ 243 000。用重组腺相关病毒rAAV-VP3感染细胞后对抗体的特异性进行免疫学评价。首先利用免疫荧光技术检测VP3基因在人膀胱癌细胞株T24、EJ细胞以及Vero细胞中的表达情况,观察到凋亡素在T24、EJ细胞中主要定位于细胞核,而在Vero细胞中则定位于细胞质。其次通过Western blotting检测纯化后的抗体能与细胞内腺相关病毒介导表达的凋亡素蛋白特异性结合。实验证明了制备的凋亡素蛋白多克隆抗体的有效性和特异性,为进一步阐明凋亡素抗肿瘤效应的分子机制及生物学特性奠定了基础。     

重组人PLCζ蛋白在昆虫细胞/杆状病毒表达系统内的表达、纯化及活性测定

PLCζ是PLC家族的一种新型同工酶,在哺乳动物卵母细胞激活中起着极其重要的作用。近年来,体外大量表达和纯化有活性的PLCζ蛋白用于结构生物学研究一直未能获得成功。本研究首次在杆状病毒表达系统中表达和纯化重组人PLCζ蛋白,首先将人PLCζ基因克隆至pFastBac-HTA质粒构建重组载体,转化DH10Bac发生位点特异性转座,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid-PLCζ;在脂质体介导下将穿梭质粒转染Sf9昆虫细胞产生重组病毒,扩增病毒感染Sf9昆虫细胞进行蛋白表达;利用Ni~(2+)亲和柱及分子筛来纯化蛋白,并通过考马斯亮蓝染色、Western blotting及飞行时间质谱对蛋白进行鉴定,并进行酶活性测定。结果显示重组蛋白在Sf9昆虫细胞感染杆状病毒后72 h达到峰值并以分泌形式表达在细胞培养基中,Ni~(2+)亲和柱及分子筛纯化后的重组蛋白经Western blotting及电离飞行时间质谱鉴定为PLCζ蛋白,酶活性可达326.8 U/mL。该实验结果为重组人PLCζ蛋白大规模生产和生物医学应用研究提供了可参考利用的技术。