黑松与松材线虫互作早期NO应答信号与外在因子的关系

松树与松材线虫互作中,NO作为重要的信号分子参与调控寄主对松材线虫入侵的应答反应,但松材线虫入侵寄主后,是松材线虫还是其代谢产物激发寄主体内NO应答信号尚不明确.本研究用松材线虫活体、线虫分泌物、虫体研磨液等分别接种黑松,研究接种早期黑松体内NO合成酶(NOS)活性和NO含量变化与后期松树症状发展的关系.结果表明:采用虫体研磨液、线虫分泌物处理后黑松体内NOS活性和NO含量均升高;各处理黑松外部均出现感病症状.说明在松树与松材线虫互作中,除线虫活体作用外,线虫体或分泌物中的物质也可激发松树体内NO应答信号的表达,诱导下游应答响应的发生,导致黑松感病.15 ～25℃条件下,随着温度升高,接种黑松体内NOS活性增强,NO含量升高,感病症状出现较早;随着干旱胁迫程度的增强,接种黑松体内NOS活性、NO含量大致呈逐步升高趋势,感病症状也较早出现.在一定范围内,温度升高和干旱程度加剧可诱发感病黑松体内NO相关信号途径表达增强,并加速病程发展.表明在一定条件下,高温干旱环境有利于松材线虫病的发生可能与寄主体内NO应答信号增强有关.     

神经元限制性沉默因子对人胰岛素基因转录调控作用的研究

为了研究神经元限制性沉默因子(NRSF)调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达,进一步寻找胰岛细胞中可能存在的其他NRSF调控基因.先用生物信息学手段对相关基因进行了分析.筛选及序列比对发现,人胰岛素核心启动子区有一段与NRSE相似的序列,提示,它可能受NRSF调控.构建了含NRSF基因的慢病毒载体,将其稳定转染于INS-1细胞.构建了3种荧光素酶报告载体:含有人胰岛素启动子-荧光素酶(hInsP-LUC)的慢病毒载体,pGL3-Basic载体和含有2拷贝NRSE样基序-荧光素酶(NRSE-LUC)的报告载体.利用稳定转染及瞬时转染实验观察NRSF对报告载体中荧光素酶活性的影响.利用电泳迁移率变动分析实验观察NRSE样基序与NRSF蛋白的结合情况,并通过竞争结合实验、引入特异性抗体实验证实探针与蛋白质结合的特异性.RT-PCR检测证实,感染空病毒的INS-1细胞不表达NRSF,感染含目的基因慢病毒的INS-1细胞能表达NRSF.将含有hInsP-LUC的慢病毒载体稳定转染于上述2种细胞,荧光素酶活性分析结果显示,NRSF的过表达能明显降低胰岛素启动子的活性.瞬时转染hInsP-LUC报告系统于上述2种细胞,结果也显示NRSF能明显抑制胰岛素启动子-荧光素酶的活性.将含有NRSE-LUC的报告载体瞬时转染于上述2种细胞,结果表明过表达NRSF的INS-1细胞组的荧光素酶相对值比对照组有明显下降.电泳迁移率变动分析实验进一步证实,此NRSE样序列可以与NRSF蛋白特异结合,这种特异结合可以被标准的NRSE序列所竞争.结果表明,人胰岛素启动子中含有NRSE样序列,该序列通过与NRSF蛋白结合从而抑制人胰岛素启动子的转录活性.这一研究工作有助于进一步了解NRSF在胰岛细胞中的调控作用.     

NRSF慢病毒干涉载体的构建及功能初步检测

为研究神经元限制性沉默因子(NRSF)负调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达,拟通过RNAi的方法降低NRSF表达以进一步观察其调控的下游基因的表达情况.构建含人胰岛素启动子-荧光素酶(HIP-LUC)的pcDNA3.1报告载体.通过RNAi序列设计软件进行NRSF干涉片段及脱靶对照片段的设计,然后构建慢病毒干涉载体.包装产生慢病毒干涉毒液,用其感染HeLa细胞获得稳定干涉NRSF的细胞株,利用RT-PCR、实时定量PCR、蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色等方法检测NRSF的干涉效果及其下游基因的表达情况,观察干涉NRSF后胰岛素启动子报告载体荧光素酶活性的变化.构建具有NRSF干涉效果的慢病毒干涉载体成功,并获得了稳定干涉NRSF及脱靶对照的HeLa细胞株,RT-PCR及实时定量PCR检测结果表明,NRSF干涉片段的干涉效率为56%(n=6,P<0.01),蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色方法检测证实干涉后NRSF蛋白表达水平明显降低.RT-PCR实验表明干涉NRSF后下游基因开始表达,荧光素酶活性分析表明,干涉NRSF后胰岛素启动子活性增强了2.4倍(n=3,P<0.01).上述结果表明,成功构建NRSF的慢病毒干涉载体并获得稳定干涉NRSF的HeLa细胞株,干涉NRSF后,其下游基因特别是胰岛素基因开始表达.这一研究工作有助于我们进一步了解NRSF在胰岛细胞发育分化中的调控作用.     

H2O2在黑松-松材线虫早期互作应答中的调控作用

松材线虫病已对中国森林资源以及生态环境造成严重破坏和威胁.近年信号分子H2O2在植物病害中的作用已成为研究热点,然而对松树-松材线虫互作中H2O2方面的功能研究不多见.本实验以三年生黑松(Pinus thunbergii)为材料,通过施用外源H2O2供给剂和抑制剂(AsA)探讨H2O2对松树-松材线虫互作体系中抗氧化保护酶、苯丙烷代谢途径的调控作用;同时对黑松感染松材线虫后体内H2O2产生的酶途径加以研究.结果表明,外源H2O2处理提前诱发了染虫黑松体内H2O2含量大幅度升高;AsA可在接种早期抑制染虫黑松体内H2O2含量,推迟了H2O2大量积累的发生.同步测定染虫黑松体内相关酶活性发现,外源H2O2处理后,染虫黑松体内APX和CAT活性下降幅度更大,MDA含量、PAL酶活性均提前积累;而外源AsA处理则推迟染虫黑松体内APX和CAT活性大幅下降的发生,延迟且削弱了MDA含量大量积累的发生和累积程度,PAL酶活性升高也滞后.同步观察黑松感病症状,发现H2O2处理组染虫黑松发病最快;仅接种松材线虫处理组次之;AsA处理组染虫黑松发病最慢.这表明,受松材线虫侵染后,黑松体内大量累积的信号分子H2O2可影响寄主体内抗氧化保护酶活性、苯丙烷代谢途径的表达,进一步影响了感病症状的表达.对黑松体内H2O2产生酶来源研究发现,黄嘌呤氧化酶(XO)抑制剂别嘌呤醇和NADPH氧化酶抑制剂二亚苯基碘(DPI)处理均能明显抑制黑松体内H2O2含量,说明XO和NADPH氧化酶均是黑松与松材线虫互作体系中内源H2O2合成的重要酶.