体细胞克隆牛产品安全分析

体细胞克隆技术是将已分化的体细胞移到去核的成熟卵母细胞中,通过体外激活和培养,再移植入受体母畜子宫内,繁殖出具有相同基因型后代的一种技术。该技术可以大幅提升繁殖效率,并提供高质、充足和营养丰富的动物食品。近年来,美国、日本和欧洲等国家相继宣布体细胞克隆动物食品可以上市。然而,目前体细胞克隆效率相当低下,即使是出生的克隆动物也往往伴随发育畸形或高死亡率等现象,在对克隆动物发育异常知之甚少的情况下,宣布克隆动物产品上市是否为时过早?以下综述了克隆牛肉、奶及其产品安全。     

基因打靶定点突变秦川牛MSTN基因

Myostatin(MSTN,肌肉生长抑制素)基因属于TGF-β超家族,对骨骼肌的生长发育具有负调控作用。该基因的功能缺失,能够引起肉用动物的"双肌"表型,从而提高产肉率。基因打靶技术是制作转基因动物的常用方法。构建了两个置换型打靶载体pA2T-Mstn4.0和pA2T-Mstn3.2,通过同源重组将G938A突变点引入秦川牛MSTN基因第三外显子。电穿孔方法转染秦川牛胎儿成纤维细胞,经过600μg/mL G418和50nmol/L GCV的药物正负筛选,共得到170个药物抗性细胞克隆。对细胞克隆进行PCR、测序及Southern blotting鉴定,结果显示,第58号细胞克隆为发生了正确同源重组的中靶细胞。牛胎儿成纤维细胞中的MSTN基因的一条等位基因被成功改造。     

草原红牛IGF-I基因5′调控区序列的生物信息学分析

胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因为多启动子基因,也是影响动物生长发育和肉用性状的重要候选基因.在克隆草原红牛IGF-I基因5′调控区1 954 bP的基因组序列基础上,利用生物信息学软件,分析了IGF-I 5′调控区的启动子结构;预测出评分在95分以上的转录因子结合位点有71个;分析结果没有发现CpG岛和TATA-box.研究结果为进一步研究IGF-I转录效率以及对草原红牛生长和肉用性状的影响奠定基础.     

乌珠穆沁白马成纤维细胞建系及其生物学特性分析

本研究以内蒙古乌珠穆沁白马(Equus caballus)雄性和雌性为实验材料,利用组织块贴壁培养法进行耳组织成纤维细胞原代建系,研究耳组织来源的细胞贴壁率、冷冻前及复苏后存活率、生长曲线,进一步绘制乌珠穆沁白马成纤维细胞核型图。实验结果显示,雌、雄乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞经组织贴壁法建系培养,生长为典型的成纤维细胞形态,并呈现“S”型生长曲线特征;细胞冷冻前后存活率存在显著差异,但仍具有较好的耐受冷冻性;根据染色体核型分析,雌、雄乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞染色体条数为2n = 64,其中31对常染色体,1对性染色体。本研究成功建立了雌、雄乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞系,并且得到可稳定培养、具有良好遗传学特性的细胞系,为后续的相关深入研究奠定了基础。     

牛朊蛋白基因prnp敲除载体的构建及真核细胞转染

利用正负筛选策略(Positive-negative selection,PNS)对中靶细胞进行富集是提高体细胞基因打靶效率常用的策略之一。将动物的朊蛋白基因prnp敲除,使其不能表达朊蛋白(传染性海绵状脑病的致病蛋白),从而使其具有抵抗Prion病感染的能力。本研究采用正负筛选策略,构建了牛prnp基因的双等位基因敲除载体,经内切酶Sac Ⅱ线性化后,再通过电穿孔转染牛胎儿成纤维细胞,分别用600μg/mL G418、200nmol/mL Ganciclovir(GCV)进行正负药物筛选,最终获得了176个药物抗性细胞克隆,进一步采用PCR、测序、间接免疫荧光试验及Western blotting试验对细胞克隆进行鉴定,结果表明,其中的9个细胞克隆为中靶细胞,证明牛prnp基因被成功敲除。本研究为牛prnp的敲除提供了可行性依据,并为体细胞核移植生产敲除朊蛋白基因的转基因动物提供供体细胞。     

草原红牛IGF—I基因5’调控区序列的生物信息学分析

胰岛素样生长因子-I（IGF—I）基因为多启动子基因,也是影响动物生长发育和肉用性状的重要候选基因。在克隆草原红牛IGF-I基因5’调控区1954bP的基因组序列基础上,利用生物信息学软件,分析了IGF—I5’调控区的启动子结构;预测出评分在95分以上的转录因子结合位点有71个;分析结果没有发现CpG岛和TATA—box。研究结果为进一步研究IGF-I转录效率以及对草原红牛生长和肉用性状的影响奠定基础。     

西伯利亚狍成纤维细胞建系及其生物学特性分析北大核心CSCD

本研究以内蒙古大青山获得野生雄性和雌性西伯利亚狍(Capreolus pygargus)为实验材料,利用组织块贴壁培养法进行气管、肺和耳3种组织成纤维细胞原代建系,研究不同组织来源的细胞贴壁率、冷冻前及复苏后存活率、生长曲线,进一步绘制狍成纤维细胞核型图并分析其G带特征。实验结果显示,气管、肺和耳3种组织成纤维细胞增殖经历潜伏期、对数生长期、平台期三个阶段,细胞形态为梭形、三角形或不规则形,是典型成纤维细胞形态;成纤维细胞呈漩涡状生长,其中气管、耳成纤维细胞生长增殖能力最强、肺成纤维细胞增殖能力较弱,气管和耳组织来源成纤维细胞呈典型“S”型细胞生长特征。染色体核型及G带分析结果显示,雄性狍成纤维细胞染色体条数为2n=70,其中,有34对常染色体,形态类型为12条近端着丝粒染色体(st),22条亚中着丝粒染色体(sm),1对性染色体,X染色体为中着丝粒染色体(m),Y染色体为近端着丝粒染色体(st),5条超数染色体(B);雌性狍成纤维细胞染色体条数为2n=70,其中,有34对常染色体,其形态类型为29条亚中着丝粒染色体(sm),5条近端着丝粒染色体(st),1对为性染色体,X染色体为亚中着丝粒染色体(sm),8条超数染色体(B)。本研究成功建立了雄性和雌性西伯利亚狍气管、肺和耳3种组织来源的成纤维细胞系,在体外培养时生长状态良好且维持了细胞的遗传信息稳定性,绘制了西伯利亚狍雄性和雌性染色体核型及G带图谱,为将来更深入开展相关研究提供材料与基本技术支撑。