圆红冬孢酵母磷酸盐饥饿诱导表达载体的构建

摘要:【目的】建立一种适用于圆红冬孢酵母代谢工程的磷酸盐饥饿诱导表达系统。【方法】对圆红冬孢酵母pho89基因5'侧翼序列进行生物信息学分析,设计相应引物,PCR扩增pho89基因启动子(pPHO89)和hsp70基因终止子(tHSP),利用RF克隆方法置换出发载体上的pPGK组成型启动子和tNOS终止子,以潮霉素磷酸转移酶基因hyg为报告基因,得到响应磷酸盐饥饿诱导的单表达盒载体pZPK-pPHO89-hyg-tHSP,利用ATMT方法转化圆红冬孢酵母,通过转化子潮霉素抗性表型鉴定pPHO89和tHSP的启动子和终止子活 性。在此基础上,构建了适合外源基因表达的双表达盒诱导表达载体pZPK-HYG-pPHO89-MCS-tHSP,并利用该载体构建了苹果酸酶重组表达菌株。【结果】成功构建了响应磷酸盐饥饿的圆红冬孢酵母诱导性表达载体,该载体在圆红冬孢酵母中可表现出启动子和终止子活性。【结论】该启动子受磷酸盐浓度的严谨调节,响应度高,操作简单,无需额外诱导剂,经济便捷,为后续圆红冬孢酵母代谢工程研究提供了基本材料。