人分泌磷蛋白2基因的克隆、原核表达与活性检测

提取人肝癌组织RNA,通过RT-PCR扩增人SPP2成熟蛋白编码区基因并克隆至原核表达载体pET-22b（＋）,将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL2l（DE3）,IPTG诱导重组蛋白表达,用Ni-NTA柱进行纯化,SDS-PAGE电泳及Western blot检测并证实目的蛋白的表达,通过重组蛋白对木瓜蛋白酶的抑制作用验证其生物学活性。重组质粒测序和酶切结果显示SPP2成熟蛋白基因已成功克隆到pET-22b（＋）。IPTG诱导重组菌后有25kDa大小的目的蛋白表达。优化诱导表达条件,获得可溶性表达的目的蛋白,纯化后纯度达90%,western blot表明其具有His标签抗原活性。重组SPP2成熟蛋白可抑制木瓜蛋白酶的水解作用（酪蛋白为底物）,重量抑制比为1∶3.1,抑制比活性为2511U/mg。     

高表达蛋白酪氨酸磷酸酶-PEST促进HepG2肝癌细胞体外增殖

为深入探讨蛋白酪氨酸磷酸酶-PEST在肝癌中的作用, 构建了真核重组表达质粒pcDNA3.1/ PTP-PEST并转染HepG2肝癌细胞, 经荧光定量RT-PCR和Western blot对转染细胞进行筛选, 选出稳定高表达PTP-PEST基因的细胞株, 并采用MTT及Western blot对高表达PTP-PEST基因的细胞株的增殖速度和生长因子受体结合蛋白2表达量进行检测, 观察到高表达PTP-PEST的细胞株内Grb2蛋白表达上调, 细胞增殖速度加快. 本研究表明, 在HepG2肝癌细胞株内, PTP-PEST可能通过影响Grb2蛋白的表达来促进细胞增殖.     

霍乱弧菌噬菌体VP2基因组序列的测定与分析

测定并分析了霍乱弧菌噬菌体VP2基因组序列,为VP2生物学特性和功能研究提供分子遗传学基础。为此构建了VP2DNA随机文库,鸟枪法(shot-gun)测定其全基因组序列。测序结果用软件Phrad-Prap拼接成最小重叠群(contig),引物步移法测定contigs问的缝隙(gap)序列,拼接后获得VP2全基因组序列。利用生物信息学技术分析’VP2基因组,最后对VP2和相关噬菌体做DNA聚合酶(DNA pol)基因的进化树分析。结果：VP2属短尾噬菌体科,基因组全长39853bp,为环状双链DNA,G C含量为50．56％,较高于霍乱弧菌测序菌株N16961基因组G C含量;VP2的基因组有碱基使用偏性;预测和注释了45个开放读码框(ORF),分析了DNA复制基因、衣壳蛋白和DNA包装基因、侵染相关基因。DNA pol进化树比较结果,VP2与链球菌噬菌体Cp-1和芽孢杆菌噬菌体GA-1分为一群。根据对VP2基因组序列的测定和分析预测了VP2的ORF,并分析了其中的功能基因,推测VP2在进化关系上属于噬菌体phi29样噬菌体。     

新的生长激素异形体基因的发现及全长cDNA的克隆

在通过大规模 ESTS技术对垂体基因表达谱的研究中 ,从垂体组织产生了 72 2 2个 ESTS,有385个 ESTs是代表生长激素 (GH)基因的 ,其中 1个为中间缺失 1 38bp的 GH异形体基因 ,并经巢式 RT- PCR及测序证实 ;该基因编码 1 71个氨基酸的前肽 ,去除信号肽后 ,其成熟肽由 1 45个氨基酸组成 ;经生物信息学处理 ,其分子量大小约 1 7k D;与正常生长激素分子内有 2个 GH受体结合位点不同 ,该新的 GH异形体分子内仅有一个生长激素受体的结合位点 .研究结果揭示 :正常垂体内存在着新的 GH异形体基因 ,该基因可能编码外周血中 1 6k D的生长激素 ;其功能可能为 2 2k D GH的生理拮挤剂 .     

基因芯片技术检测3种食源性致病微生物方法的建立

建立一种运用多重PCR和基因芯片技术检测和鉴定志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157的方法, 为3种食源性致病菌的快速检测和鉴定提供了准确、快速、灵敏的方法。分别选取编码志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)、沙门氏菌肠毒素(stn)基因和致泻性大肠杆菌O157志贺样毒素(slt)基因设计引物和探针, 进行三重PCR扩增, 产物与含特异性探针的芯片杂交。对7种细菌共26株菌进行芯片检测, 仅3种菌得到阳性扩增结果, 证明此方法具有很高的特异性。3种致病菌基因组DNA和细菌纯培养物的检测灵敏度约为8 pg。对模拟食品样品进行直接检测, 结果与常规细菌学培养结果一致, 检测限为50 CFU/mL。结果表明：所建立的基因芯片检测方法特异性好, 灵敏度高, 为食源性致病菌的检测提供了理想手段, 有良好的应用前景。