解脂耶氏酵母脂肪酶基因lip1的克隆、密码子优化及功能表达

摘要：【目的】克隆解脂耶氏酵母（Yarrawia lipolytica）脂肪酶基因lip1,并通过密码子优化,首次实现其在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的诱导型和组成型表达。【方法】通过PCR扩增Y. lipolytica脂肪酶基因lip1,根据P. pastoris密码子偏爱性,运用重叠延伸PCR合成改造后基因MLip1,将其分别克隆至诱导型分泌载体pPIC9K和新构建的组成型分泌载体pGAP9K上,电转至P. pastoris GS115中,G418抗性筛选得到高拷贝转化重组子,摇瓶发酵     

解脂耶氏酵母新型表达载体构建及癌基因rho在其中的表达

为了简化解脂耶氏酵母表达载体构建过程、消除抗生素污染,将mel基因(编码酪氨酸酶)作为新型报告基因用于构建新型酵母表达载体,利用组装PCR人工合成基因mel,并用重叠PCR将其与同源组成型强启动子p TEF、分泌性信号肽XPR2pre及强终止区LIP2t融合,构建新型胞外及胞内表达载体,并利用其在解脂耶氏酵母野生菌株中表达人源癌基因rho.成功获得mel全基因并将其与启动子、信号肽和终止区融合,得到融合片段TXML,用其替换原有表达载体的筛选标记基因ura3d4,构建得到新型胞外及胞内表达载体pINA1297-M和pINA1297-a-M,转化后的酵母阳性转化子性状明显,随后利用此新型表达系统获得可溶性异源蛋白Rho.首次实现了将mel作为一种便捷、价廉、无污染的新型筛选标记基因运用于非常规酵母表达系统中,更为mel在其它真核表达系统中的运用奠定了技术基础;获得的可溶性Rho蛋白可为研究其性质、结构、功能及与Rho癌基因家族其它成员的相互作用提供条件.     

解脂耶氏酵母脂肪酶LIP4和LIP5在毕赤酵母中的异源表达及酶学性质

【目的】克隆解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)脂肪酶LIP4和LIP5的cDNA序列,研究其基因结构,并实现其在毕赤酵母中的功能表达,以探讨其酶学性质。【方法】利用反转录PCR首次扩增LIP4和LIP5的编码基因,用SignalP 3.0分析其基因序列,然后分别构建胞内表达载体pPIC3.5K-Lip4、pPIC3.5K-Lip5和胞外表达载体pPIC9K-Lip4、pPIC9K-Lip5,将其转入毕赤酵母GS115中表达,以NTA树脂纯化酶蛋白,研究其酶学性质。【结果】cDNA序列测序结果显示两者均不含内含子,酶蛋白的氨基酸序列中含有典型脂肪酶的活性三联体结构和五肽保守区;酶学性质研究表明,两者的最适底物均为癸酸(C8)对硝基苯酚酯,最适pH为7.0,最适温度为40℃,但LIP4对pH和温度更敏感;两者均能被Ca2+激活,且LIP5还能为Mg2+激活,但均被Hg2+、乙二胺四乙酸(EDTA)和苯甲基磺酰氟(PMSF)强烈抑制。【结论】首次克隆了解脂耶氏酵母脂肪酶LIP4和LIP5编码基因,实现了其在毕赤酵母中的活性表达,并初步研究了其酶学性质,为上述脂肪酶的应用及进一步深入研究解脂耶氏酵母脂肪酶家族奠定了基础。     

带His-tag的解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2在毕赤酵母中的表达及纯化

将去自身信号肽并且N-端带6×His标签的YlLip2基因克隆至表达载体pPIC9K中,电转化GS115获得高效表达脂肪酶His₆-YlLip2的基因工程菌。筛选到的阳性克隆子摇瓶发酵脂肪酶活力最高为400U/ml。对重组毕赤酵母在10 L发酵罐中表达His₆-YlLip2的分批补料发酵工艺进行了初步优化,探讨了培养基、pH、温度对生物量和重组蛋白表达量的影响。结果表明:采用FM22培养基,诱导温度为25℃,pH 5.0,甲醇诱导114 h后His₆-YlLip2的最高酶活力达到3160U/ml。SDS-PAGE分析表明,蛋白的分子量大约为38kDa。重组的His₆-YlLip2经镍柱一步纯化后的纯度达到95.43%,比酶活达到4250U/mg。     

解脂耶氏酵母表达系统研究进展

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是非常规酵母中具代表性的一种,它底物广泛,尤其能利用有机酸（柠檬酸、异柠檬酸）,蛋白类（蛋白酶、脂肪酸、酯酶、磷酸酶、α-甘露糖苷酶、RNase）。烷烃类廉价物质作为底物分泌大量的代谢产物,自上世纪40年代被发现以来,越来越受到研究者的重视,并于上世纪90年代被开发成为一种新的酵母表达系统,用于42种异源蛋白的高效表达。综述了解脂耶氏酵母表达系统及其特点,有利于研究者从转录和翻译的水平研究异源蛋白在此菌中的表达分泌路径以及寻找到调控型启动子。     

解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2的表面展示及其酶学性质

表面展示酶作为全细胞催化剂具备诸如能提高酶的稳定性、省去纯化过程、节约成本等优点。脂肪酶是应用最为广泛的工业酶之一。本研究利用酿酒酵母细胞壁蛋白Cwp2作为锚定蛋白,将解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2展示在酿酒酵母细胞表面,以制备脂肪酶全细胞催化剂。Lip2被融合到Cwp2的N端,Cwp2通过其C端的GPI锚定信号共价结合到细胞壁上。表面展示的Lip2可以水解三丁酸甘油酯及对硝基苯酚辛酸酯(pNPC),其pNPC水解酶活达到4.6U/g干细胞。作为全细胞催化剂,表面展示的Lip2具备良好的催化特征,其最适温度为40°C,最适pH为8.0,同时还具备良好的有机溶剂稳定性。     

利用a凝集素在酿酒酵母表面展示解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2

[目的]将解脂耶氏酵母胞外脂肪酶Lip2展示在酿酒酵母表面,构建全细胞催化剂.[方法]采用PCR方法扩增得到解脂耶氏酵母胞外脂肪酶Lip2成熟肽编码基因LIP2,将其连接到AGA2基因的下游构建表面展示载体pCTLIP2.分别以橄榄油、三丁酸甘油酯和对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)为底物检测展示的脂肪酶酶活.在此基础上,对野生菌及工程菌的酶学性质进行比较.[结果]展示Lip2的酿酒酵母重组菌株在半乳糖的诱导下,表现出水解橄榄油、三丁酸甘油脂以及pNPP的活性,20℃诱导72h时酶活达到最高,为182 U/g干细胞.对展示的Lip2的酶学性质研究表明,其最适温度为40℃,最适pH为8.0,温度稳定性比自由酶有所提高,50℃温浴4 h后残余酶活为其最大酶活的23.2%.以不同碳链长度的对硝基苯酚酯为底物检测其底物特异性,结果显示其水解C8,C12,C16对硝基苯酚酯活性相近,均远高于对硝基苯酚丁酸酯(C4)的水解酶活.[结论]对于Lip2,a凝集素系统是一个有效的展示系统,利用该系统成功将Lip2展示在酿酒酵母表面,从而构建了酿酒酵母全细胞催化剂,该全细胞催化剂具有良好的潜在应用前景.