应用纤维素结合域标签构建谷氨酸棒状杆菌表达系统

为优化谷氨酸棒状杆菌表达系统的纯化工艺,合成里氏木霉的CBD基因,将其与谷氨酸棒状杆菌分泌表达载体pXMJ19-sp连接,构建以CBD为纯化标签的重组载体pXMJ 19-sp-CBD.在该载体中插入GFP基因并转化至谷氨酸棒状杆菌,可获得分泌表达融合蛋白GFP-CBD的重组菌.该菌经IPTG诱导后的发酵液在紫外灯下显示强烈的绿色荧光,重组蛋白的分泌表达量达200 mg/L.利用CBD标签对纤维素柱的可逆性吸附,可直接对谷氨酸棒状杆菌分泌到培养基中的重组蛋白进行纯化,从而简化工艺和降低成本,为工业化大生产奠定基础.     

检测瓜氨酸和非对称二甲基精氨酸的化学发光方法

非对称二甲基精氨酸（ADMA）是内源性一氧化氮合酶抑制剂,被公认是一种与心血管疾病、糖尿病、性功能障碍和肾功能衰竭等多种疾病密切相关的危险因子. 本文通过化学发光法检测瓜氨酸或ADMA经鸟氨酸氨基甲酰转移酶（ArcB）和氨基甲酰磷酸激酶（ArcC）偶联生成的ATP,并对该方法检测的灵敏度和动态范围进行了初步评价.1）从绿脓杆菌中克隆了鸟氨酸氨基甲酰转移酶和氨基甲酰磷酸激酶,转化大肠杆菌实现高效可溶性表达,用镍柱亲和纯化得到融合蛋白,TLC薄层层析法定性和测氨法定量验证了融合蛋白活性.2）用化学发光法检测了瓜氨酸或ADMA经相应酶偶联反应后的产物ATP,并且对实验进行了优化,结果表明两者都能在偶联酶作用下催化释放ATP,相应的底物浓度检测下限为01 μmol/L,检测结果接近正常生理血清中ADMA的浓度,且远低于正常生理血清中瓜氨酸浓度. 用正常尿液样品检测结果表明,该方法可行,为下一步血清和血浆样品的检测奠定了基础.     

急性ST 段抬高心肌梗死患者多支病变血运重建治疗策略的临床研究

目的:分析急性ST段抬高心肌梗死(acute ST segmentelevation myocardial infarction,STEMI)伴多支血管病变行急诊经皮冠状动脉介入(percutaneous coronary intervention,PCI)治疗的策略,制定患者血运重建时机及最佳方案。方法:收集2008.10-2012.10期间急性ST段抬高心肌梗死伴多支血管病变行急诊PCI治疗患者资料,其中仅行罪犯血管PCI治疗组162例,多支血管PCI治疗组50例、阶段PCI治疗组112例,分析比较各组间短期(3个月)死亡率和1年、2年、3年死亡率及主要心血管事件(major cardiovascularevents,MACE)发生率。结果:①多支血管PCI组较罪犯血管PCI组有更高的短期死亡率(4.0%vs 2.5%,P0.05),但其降低MACE发生率(12.0%vs 15.4%,P0.05);②阶段PCI组较罪犯血管PCI组有更低的死亡率(短期和1年、2年、3年死亡率均P0.05)及MACE发生率(11.6%vs 15.4%,P0.05);③多支血管PCI组较阶段PCI组有更高的短期死亡率(4.0%vsl.8%,P0.05),长期随访无明显不同(6.0%vs 5.4%,P0.05);MACE的发生率无明显差异(12.0%vs 11.6%,P0.05)。结论:当血流动力学稳定时,合并多支血管病变的急性ST段抬高心肌梗死仅对罪犯血管行PCI,随后行阶段PCI处理非梗死病变血管,这一策略能显著改善患者的临床预后。     

非对称二甲基精氨酸水解酶的表达纯化及其酶学性质的研究

非对称二甲基精氨酸水解酶(dimethylarginine Dimethylaminohydrolase,DDAH)是酶学循环法检测早期急性心肌梗塞(acute myocardial infarction,AMI)的生物标记物——非对称二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA)的重要工具酶.为获得高活性DDAH,从绿脓杆菌的基因组中扩增目的基因,构建高效表达DDAH的重组菌E.coli BL 21(pET-28a-DDAH).该菌的可溶性DDAH表达量达100mg/L,经超声破碎后的上清液通过镍柱纯化,可获得纯度达到95％以上的重组DDAH.Q柱的精制可提高它的稳定性,使其能够在常温下长期保持酶活.该重组酶的单位酶活,Km值和Vmax分别为0.5U/mg,3.04 mM和8.07mM/h.最适反应温度和pH分别为35℃和pH =6,在10℃～40℃和pH5.0～ pH9.0的范围内稳定.该重组酶可形成多聚体,但并不影响酶活.最后,利用发酵罐扩大生产规模,有望进行克级生产,为新型ADMA检测试剂盒的开发和药物筛选模型提供材料基础.