热胁迫对二化螟幼虫血淋巴细胞内活性氧、HSP90及细胞凋亡的影响

为探讨热激条件下二化螟Chilo suppressalis幼虫体内生理上的保护反应,本研究应用流式细胞术分析了热胁迫对二化螟幼虫血淋巴细胞内活性氧（ROS）、热休克蛋白90（HSP90）的产生和对细胞凋亡的影响。结果表明：暴露于33℃,36℃和39℃的二化螟5龄幼虫的ROS与对照（28℃）相比显著提高,分别增加了1.71,1.69和1.38倍;当温度达到33℃以后,ROS不再显著增加。实时定量PCR结果显示,二化螟HSP90基因在热胁迫诱导下表达。流式细胞术检测表明,HSP90的变化与在mRNA水平上的变化高度一致,热胁迫处理没有造成血淋巴细胞凋亡的显著变化。这些研究结果进一步证明热胁迫产生的ROS激活HSP90基因的表达,HSP90蛋白在保护机体免受ROS引起的伤害中起着重要作用,能够抑制血淋巴细胞凋亡的发生。     

新城疫病毒FMW株体外溶瘤作用及其机制分析

[目的]筛选出能高效抑制多种人肿瘤细胞生长增殖的新城疫(New Castle disease virus,NDV)毒株,为进一步构建重组高效靶向溶瘤毒株奠定基础.[方法]以体外噻唑蓝法测定NDV对A549、SMMC7721等肿瘤细胞及人胚干细胞L-02、人胚肾细胞HEK293等的生长抑制率,空斑试验确定病毒滴度及感染复数.利用形态学观察、Hoechst荧光染色、流式细胞术及免疫印迹等分析了NDV-FMW诱导肿瘤细胞凋亡的细胞生物学变化及其机制.[结果]从近50株NDV中筛选出NDV-FMW,以20 MOI病毒作用A549、SMMC7721等肿瘤细胞48 h,细胞生长抑制率达60%,NDV-FMW诱导肿瘤细胞发生凋亡,效应呈时间和剂量的依赖性,凋亡细胞出现核染色质断裂、浓缩及二倍体亚峰,细胞周期阻滞于GO/G1期,此外,病毒感染A549细胞16 h后开始检测到活化的Caspase-3裂解片段及PARP裂解大片段.[结论]NDV-FMW株体外能高效抑制肿瘤细胞的增殖,并经Caspase-3途径诱导肿瘤细胞凋亡.FMW株具有自主知识产权,其良好的体外溶瘤能力为进一步探讨体内抗肿瘤及临床试验的进行奠定了基础,并有可能为恶性肿瘤的治疗提供新的生物制剂.     

嵌合鞭毛蛋白在大肠杆菌BL21(DE3) 和沙门菌SL5928中的表达与组装分析

鞭毛蛋白根据能否组装可以表达为单体或多聚体。目前,关于它们之间的区别少有报道。文中,将重组质粒pET-fliC/M2e2分别导入大肠杆菌BL21(DE3) 和沙门菌SL5928中来表达嵌合鞭毛蛋白mfliC/M和pfliC/M,然后分析它们的组装特性。SDS-PAGE结果表明,两重组菌成功表达了嵌合鞭毛蛋白。透射电镜观察显示,在重组大肠杆菌表面未见鞭毛,而重组沙门菌表面呈现鞭毛。将嵌合蛋白纯化后,圆二色谱 (Circular dichroism,CD) 分析表明,两者的CD信号明显不同,pfliC/M的CD信号与野生型鞭毛蛋白一致,而mfliC/M基本上没有CD信号出现。动态光散射分析表明,mfliC/M的聚集程度明显低于pfliC/M。将嵌合蛋白转染小鼠腹腔细胞3 h后,两者均能诱导产生IL-1β,但mfliC/M组高于pfliC/M组。以上结果对于鞭毛蛋白表达形式的选择具有重要的参考价值。     

小鼠巨噬细胞系体外感染卡介苗的应答

【目的】探讨小鼠巨噬细胞系RAW264.7体外感染卡介苗的应答。【方法】体外感染RAW264.7细胞23h后,分析细胞形态和细胞表面共刺激分子的表达。然后去除培养上清中的卡介苗,继续培养不同时间,通过CFSE、annexin V/PI和Rh123标记,分析宿主细胞的应答。【结果】卡介苗感染23h后,细胞生长状态良好,细胞内能明显观察到吞噬泡中的BCG。细胞表面共刺激分子CD40、CD54、CD80、CD86、CD11b的表达明显升高,CD11c、I-Ad以及H-2Kd的表达变化不明显。CFSE标记卡介苗后,随着培养时间的延长,荧光强度逐渐减弱,但是4天后仍然明显地高于对照组。除去培养上清中的卡介苗后继续培养,含有卡介苗的细胞逐渐减少,继续培养60h后基本检测不到。另外,卡介苗感染不能诱导细胞凋亡,线粒体膜电位先升高后降低,5d后,基本上与对照组一致。【结论】通过以上分析,为卡介苗免疫机理的研究提供了重要数据。     

小鼠巨噬细胞系体外感染BCG的应答

摘要：【目的】探讨小鼠巨噬细胞系RAW264.7体外感染BCG的应答。【方法】体外感染RAW264.7细胞23 h后,分析细胞形态和细胞表面共刺激分子的表达。然后去除培养上清中的BCG,继续培养不同时间,通过CFSE、annexin V/PI和Rh123标记,分析宿主细胞的应答。【结果】BCG感染23h后,细胞生长状态良好,细胞内能明显观察到吞噬泡中的BCG。细胞表面共刺激分子CD40、CD54、CD80、CD86、CD11b的表达明显升高,CD11c、I-Ad以及H-2Kd的表达变化不明显。CFSE标记BCG后,随着培养时间的延长,荧光强度逐渐减弱,但是4天后仍然明显地高于对照组。除去培养上清中的BCG后继续培养,含有BCG的细胞逐渐减少,继续培养60 h后基本检测不到。另外,BCG感染不能诱导细胞凋亡,线粒体膜电位先升高后降低,5天后,基本上与对照组一致。【结论】通过以上分析,为BCG免疫机理的研究提供了重要数据。     

减毒鼠伤寒沙门菌体内定位分析…

分析减毒鼠伤寒沙门菌口服感染后在小鼠体内定位的情况.将构建的红色荧光蛋白(RFP)原核质粒pYA33-DsRed,以电穿孔法转化减毒鼠伤寒沙门菌X4550,重组菌命名为X4550(33-DsRed).重组菌分别感染巨噬细胞RAW264.7和骨髓源树突状细胞(BMDC),并用流式细胞术检测红色荧光细胞荧光强度.此外,以不同剂量重组菌口服免疫BALB/c小鼠,并于免疫后1d、2d、3d、5d、7d取小鼠脾、肝、肠系膜淋巴结(MLN)、派伊尔氏结(PP)、腹股沟淋巴结(ILN)细胞,检测各组织器官中的红色荧光阳性细胞百分率.重组菌对RAW264.7细胞和BMDC均具有良好的侵袭力.口服小鼠后,第1d,仅在MLN及PP中检测到RFP阳性细胞,其中PP中阳性细胞达到1.4%;第2 d,在ILN中达到0.4%;第3 d,各个组织器官中RFP阳性细胞均有上升趋势,此时在脾、肝中也检测到RFP阳性细胞.第5 d,RFP阳性细胞均减少,第7 d则未检测到任何RFP阳性细胞.减毒鼠伤寒沙门菌具有良好的侵袭力,其黏膜移行方式以及对免疫组织器官靶向定位性,在优化黏膜疫苗以及提高疫苗免疫效力等方面都具有重要作用.     

产单核细胞李斯特菌actA/plcB缺失株的构建及其生物学特性

产单核细胞李斯特菌的毒力因子与该菌在细胞间扩散、传播有着直接的关系,其中肌动蛋白聚集因子ActA是细菌由细胞浆扩散至相邻细胞所必须的因子,而广谱磷脂酶C则参与具有双层膜吞噬体的裂解过程.[方法]本研究中利用同源重组技术成功构建了毒力因子ActA和PC-PLC双缺失的突变株,[目的]并对突变株的毒力和免疫应答潜能进行评价.[结果]Western blot和磷脂酶活性测定实验,分别从蛋白质水平上证实actA和plcB基因的缺失.突变株的毒力显著降低,对小鼠半数致死剂量比野生型菌株提高约10 3倍,但仍然保持较好地诱导T细胞应答的能力,并且能完全保护野生型细菌致死剂量的攻击.实验结果不仅表明ActA和PC-PLC是产单核细胞李斯特菌的重要毒力因子,而且证实安全性提高的突变株依然保持有较强地诱导细胞免疫应答的能力.[结论]因此,该突变株的获得不仅对李斯特菌病的预防具有重要作用,而且为构建预防人类和动物疫病的疫苗载体奠定了基础,此外对于阐明LM毒力因子的致病机理与免疫保护作用提供了条件.     

表达结核抗原的减毒重组李斯特菌的免疫生物学特性北大核心CSCD

【目的】结核病是一种由结核分枝杆菌复合群引起的严重危害人类健康的慢性传染病,研制预防结核病的新型疫苗对于有效控制结核病具有重要的公共卫生意义。【方法】本研究对表达M.tb融合蛋白的重组李斯特菌LMΔhly::Ag85b-esat-6的免疫生物学特性进行了初步研究。【结果】实验结果显示,重组菌溶血活性丧失,对C57BL/6小鼠的半数致死剂量提高了4个log值,以0.1 LD50的剂量尾静脉注射C57BL/6小鼠,5天时被完全清除,病理切片结果未显示明显病理变化,表明重组菌具有良好的安全性。以尾静脉途径免疫C57BL/6小鼠,对其诱导的免疫应答测定结果表明,重组菌所运送的结核抗原能诱导小鼠Th1型免疫应答,激发较强的结核抗原特异性的CTL效应。【结论】上述实验结果表明,表达结核分枝杆菌融合蛋白的减毒重组李斯特菌是一种安全的结核病疫苗候选株,具有潜在的应用价值。     

新城疫病毒FMW株体外溶瘤作用及其机制

摘要：【目的】筛选出能高效抑制多种人肿瘤细胞生长增殖的新城疫（New Castle disease virus, NDV）毒株,为进一步构建重组高效靶向溶瘤毒株奠定基础。【方法】以体外噻唑蓝法测定NDV对A549、 SMMC7721等肿瘤细胞及人胚干细胞L-O2、人胚肾细胞HEK293等的生长抑制率,空斑试验确定病毒滴度及感染复数。利用形态学观察、 Hoechst荧光染色、流式细胞术及免疫印迹等分析了NDV-FMW诱导肿瘤细胞凋亡的细胞生物学变化及其机制。【结果】从近50株NDV中筛选出NDV-FMW,以     

用小鼠模型分析表达牛结核分枝杆菌Ag85B重组腺病毒的细胞免疫特性

【目的】构建表达牛结核分枝杆菌抗原Ag85B重组腺病毒rAd-Ag85B,并用小鼠模型分析其细胞免疫特点。【方法】采用PCR方法,扩增结核分枝杆菌Ag85B的编码基因fbpB,测序后构建pDC516-Ag85B重组质粒。利用脂质体将pDC516-Ag85B与pBHGfrtΔE1,3FLP共转染Ad293细胞包装成重组病毒rAd-Ag85B。空斑纯化后用电镜负染、目的基因转录和蛋白表达进行rAd-Ag85B验证。同时将rAd-Ag85B和rAd(wtAd)分别经皮下注射免疫BALB/c小鼠,二免二周后取小鼠脾脏细胞,进行CD69表面分子表达、淋巴细胞增殖和ELISPOT实验分析。【结果】在电镜下能观察到包装的重组病毒粒子,且在转录和蛋白水平上验证了rAd-Ag85B构建成功。免疫试验结果显示,rAd-Ag85B能激活CD4+T和CD8+T细胞表面分子CD69的表达,并引起淋巴细胞增殖。ELISPOT表明rAd-Ag85B呈现Th1免疫特点。【结论】成功构建的rAd-Ag85B能引起机体针对PPD蛋白或Ag85B多肽的Th1免疫应答。