高山被孢霉ATCC 32222中细胞色素b5还原酶I的克隆、表达和功能鉴定

【目的】鉴定产油微生物高山被孢霉ATCC 32222中细胞色素b_5还原酶Ⅰ的功能。【方法】将高山被孢霉ATCC 32222中膜结合细胞色素b_5还原酶Ⅰ基因与人可溶性细胞色素b_5还原酶基因序列比对,去除该基因N端穿膜区域后,与人可溶性细胞色素b_5基因分别在大肠杆菌中异源表达;通过钴离子亲和层析、离子交换和分子排阻色谱等方法对表达产物进行纯化;以2,6-二氯靛酚钠(DCIP)为底物,测定细胞色素b_5还原酶Ⅰ的体外活性及其对NADH和NADPH的偏好性;在反应体系中存在NADH时,通过全波长扫描方法检测细胞色素b_5还原酶Ⅰ与细胞色素b_5的相互作用。【结果】高山被孢霉ATCC 32222中膜结合细胞色素b_5还原酶Ⅰ被成功可溶表达,经纯化后检测到体外活性:使用NADH时酶活为564.57 U,使用NADPH时为51.97 U;在NADH存在时,细胞色素b_5还原酶Ⅰ能够还原细胞色素b_5,其吸收峰从411 nm偏移至422 nm,并在521 nm和554 nm处吸光值增加。【结论】细胞色素b_5还原酶Ⅰ N端穿膜区域的去除增加了其可溶性,并保持了蛋白质活性;高山被孢霉ATCC 32222中细胞色素b_5还原酶Ⅰ基因编码的是一种NADH-细胞色素b_5还原酶,其在体外能与细胞色素b_5相互作用。     

高山被孢霉中Δ9脂肪酸脱饱和酶的表达、纯化和其细胞色素b_5功能域的鉴定

在毕赤酵母中表达和纯化源自高山被孢霉ATCC 32222的膜结合Δ9-I脂肪酸脱饱和酶,测定其活性,并探究其细胞色素b_5功能域的性质。构建含有高效纯化标签ZZ-tag的表达载体;用Western blotting和SDS-PAGE筛选Δ9-I脂肪酸脱饱和酶高表达量转化子;通过梯度离心和去垢剂筛选确定膜蛋白质提取条件;采用IgG亲和纯化色谱和阴离子交换色谱对Δ9-I脂肪酸脱饱和酶进行纯化;利用酿酒酵母细胞破碎物为底物考察Δ9-I脂肪酸脱饱和酶活性;通过波长扫描和Na_2S_2O_4还原实验对Δ9-I脂肪酸脱饱和酶细胞色素b_5功能域进行表征。结果显示,目的蛋白质被成功表达并筛选出高表达量转化子;20 000g离心1h为最佳膜分离条件,Fos-Choline-16为最佳去垢剂;纯化后的Δ9-I脂肪酸脱饱和酶结构完整,具有细胞色素b_5功能域;在酿酒酵母提取物中Δ9-I脂肪酸脱饱和酶对C16:0和C18:0底物的转化效率分别为(16.88±9.32)%和(20.61±7.55)%;波长扫描显示Δ9-I脂肪酸脱饱和酶在411nm处有强吸收,并且在Na_2S_2O_4作用下被还原至422nm,说明细胞色素b_5功能域在体外能够被还原。因此,含有细胞色素b_5功能域的脂肪酸脱饱和酶的首次成功表达、纯化和鉴定为亚铁血红素脂肪酸脱饱和酶脱饱和反应机制的研究奠定了基础。