细菌在线虫生防中应用的研究进展

在具有杀线虫能力细菌的特征、作用方式及其在线虫生防中的潜在应用等方面,结合作者的研究工作,对国内、外的一些研究进展进行了综述,并提出了研究展望。     

精噁唑禾草灵降解菌株Rhodococcus sp.DSB-1分离鉴定、降解机制及其应用研究

【目的】分离并鉴定精噁唑禾草灵高效降解菌株,为开发高效降解菌剂,强化精噁唑禾草灵原位修复,保证黄瓜产品安全提供菌株资源和理论依据。【方法】利用富集培养的方法分离降解菌株,并通过形态学、生理生化特征和16S rRNA基因进化分析进行鉴定;HPLC/MS鉴定菌株降解精噁唑禾草灵的中间产物,采用鸟枪法建库克隆降解过程中关键的水解酶基因,并进行异源表达,利用Michaelis-Menten双倒数曲线图测定酶动力学参数;通过正交试验确定菌株液态发酵参数,并通过对黄瓜灌根接种的方式,研究降解菌株对黄瓜根际土壤中精噁唑禾草灵的降解以及甘露醇对降解效率的强化作用。【结果】Rhodococcus sp. DSB-1在24 h内能将100 mg/L精噁唑禾草灵完全转化为精噁唑禾草灵酸,降解最适温度和pH分别为30℃和8.0。克隆得到一个精噁唑禾草灵水解酶基因,命名为pepE。水解酶PepE对精噁唑禾草灵的K_m为28.2μmol/L,k_(cat)/K_m为11.0 L/(μmol·s)。在发酵温度30℃、通气量1:0.4、搅拌速度200 r/min、培养时间48 h条件下,液态发酵所得菌剂对精噁唑禾草灵的降解效率最高。投加至黄瓜根际的菌株DSB-1可以在黄瓜根系定殖,12d内完全降解黄瓜根际环境中10mg/kg的精噁唑禾草灵。此外还发现添加甘露醇可强化菌株的修复能力,降解效率相对于未添加的处理提高14.8%。【结论】菌株DSB-1具有原位修复精噁唑禾草灵污染土壤的潜力。     

灰盖鬼伞过氧化物酶功能表达及部分酶学特性

摘要:【目的】旨在用毕赤酵母高效表达灰盖鬼伞过氧化物酶。【方法】借助DNAworks 3.1软件设计、优化引物,用自己构建的基因合成、定点突变平台合成了毕赤酵母密码子偏好性的灰盖鬼伞过氧化物酶基因,测序后构建在表达载体pPICZαA上,整合于巴斯德毕赤酵母GS115染色体,来自酿酒酵母的α因子作为信号肽序列指导重组蛋白的分泌表达。从82个PCR检测为阳性的酵母转化子中筛选出6株高Zeocin抗性的菌进行表达,选表达酶活性最高的作为实验菌株命名为CIP/GS115。【结果】以ABTS为底物时,CIP/GS115 在甲醇诱导第4天酶活最高达到487.5 U/mL,是目前摇瓶培养诱导表达灰盖鬼伞过氧化物酶活性最高报道。纯化后的酶最适反应温度为25℃,45℃酶反应速度是最适温度时的61.5%,在低于40℃时比较稳定,超过45℃稳定性迅速下降。最适反应pH 为5.0,在pH 4.5－6.5之间比较稳定。以不同的底物研究纯酶底物特异性发现最适底物的顺序是:ABTS ＞ 愈创木酚＞ 2,6-二甲氧苯酚＞ 2,4-二氯苯酚＞ 苯酚。【结论】灰盖鬼伞过氧化物酶在毕赤酵母中的高效分泌表达和高的特殊活性为该酶在废水处理、染料脱色等方面的工业化应用奠定了一定基础。     

一株北里孢菌株的分离鉴定及其对松材线虫的致病性

【目的】筛选、鉴定出对松材线虫杀灭活性较高的放线菌菌株,并确定生防菌株的毒力因子。【方法】采用平板活性测试及代谢杀虫活性检测方法进行筛选,采用形态学及16S rDNA序列分析等进行鉴定。对发酵液中的活性物质稳定性分析后,利用醇沉、萃取、层析、气相色谱/质谱分析等方法分离纯化出杀虫毒力因子。【结果】从河南南阳宝天曼的腐木及枯枝落叶样品中共分离获得了79株放线菌,从中筛选出对松材线虫有灭活作用的放线菌6株,其中分离株C620菌株对松材线虫的灭活性最高:该菌株的发酵液处理松材线虫48、60 h后线虫的死亡率分别达到60.0%、81.5%。结合该菌株的形态学、生理学特征及16S rDNA序列分析等结果将其归为北里孢菌属中的一个种,菌株编号Kitasatospora sp.strain C620。该菌株的发酵液中杀线虫活性物质的热稳定性、光稳定性及耐储藏性均较强,在中性偏碱性环境较稳定;经pH纸电泳层析初步确定该物质属于碱性水溶性物质。对菌株C620发酵液分离纯化,得到活性化合物为1-苯基-3-(2-吡啶)-5-吡唑啉酮。【结论】获得一株松材线虫高效生防菌Kitasatospora sp.strain C620,其活性物质为1-苯基-3-(2-吡啶)-5-吡唑啉酮。     

松材线虫生防细菌的筛选、鉴定及其毒性因子的初步研究

从河南南阳不同农田的植物根部采取土壤样本,共分离获得了198株细菌。通过毒性测试和平板生测从中筛选出松材线虫生防细菌6株,其中NS-3菌株对松材线虫的杀灭活性最高。结合该菌株的形态学、生理学特征及16S rDNA序列分析等结果将该菌株归为芽孢杆菌属,命名为Bacillus sp.strain NS-3。将该细菌液体培养的上清液和上清蛋白粗提物分别处理松材线虫48h后线虫的死亡率分别达到50%和100%;线虫死亡后虫体消解。然而,细菌的上清蛋白粗提物经煮沸变性后,基本丧失了对松材线虫的侵染活性,结果显示细菌Bacillus sp.strain NS-3的杀线虫活性物质主要要存在于细菌培养上清液中,并且为热不稳定性物质。     

松材线虫伴生菌中产纤维素酶细菌的筛选、鉴定及其相关基因的克隆

[目的]从松材线虫伴生菌中筛选出高效降解纤维素的细菌菌株,初步鉴定后,对其相应的纤维素酶基因尝试克隆.[方法]首先从河南南阳松材线虫病疫区采集到的木材样本中,分离获得松材线虫.采用刚果红平板初筛法,从松材线虫伴生菌中获得具有分泌较高活性纤维素酶的细菌菌株.基于该菌株的形态学、生理学及16 s rDNA序列特征等对高活性菌株进行分类鉴定.设计兼并引物,从高活性菌株中克隆该菌株的纤维素酶基因,并进行序列分析.[结果]获得7株具有分泌较高活性纤维素酶的细菌菌株,其中编号为C8的菌株酶活最高.经鉴定该菌株归为肠杆菌属,命名为Enterobacter sp.C8.进一步从C8菌株中成功克隆出该菌株的一个全长1104 bp的纤维素酶基因(GenBank JQ845065),在NCBI比对后发现该基因分别与产气肠杆菌( Enterobacter aerogenes) KCTC 2190的纤维素合成酶亚单位BcsC的核苷酸序列有97％的同源性,氨基酸序列有92％的同源性 ;与克雷白氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)的endo-1,4-D-glucanase基因有82％的同源性,与不可培养的细菌内切纤维素酶基因有82％的同源性.[结论]本文首次从松材线虫伴生菌中筛选到了一株简单的产纤维素酶的细菌菌株并从中克隆出了一个新型纤维素酶基因,为下一步进行新能源的利用奠定了理论基础.     

蠼螋肠道中碱性内切葡聚糖酶基因的克隆表达及功能分析

【目的】从蠼螋肠道细菌菌株Q5中获得一个新型耐碱纤维素酶基因,通过异源表达、酶学性质及功能分析,旨在为以后进一步研究开发高温碱性纤维素酶提供一些理论参考。【方法】采用刚果红平板初筛法,从河南南阳宝天曼国家级自然保护区落叶堆下的昆虫蠼螋肠道中,获得具有分泌较高活性碱性纤维素酶的细菌菌株。基于该菌株的形态学、生理学及16S rRNA序列特征等对高活性菌株进行分类鉴定。并通过设计简并引物,从高活性菌株中克隆出该菌株的纤维素酶基因,并进行序列分析,并导入大肠杆菌BL21中表达。【结果】获得1株具有分泌较高活性碱性内切葡聚糖酶的细菌菌株Q5,经鉴定为甲基营养型芽孢杆菌,进一步从Q5菌株中成功克隆出该菌株的一个全长1500 bp的内切葡聚糖酶基因(GenBank KR067575),在NCBI比对后发现该基因的氨基酸序列与芽孢杆菌菌株LM 4-2的耐碱性β-1,4-内切葡聚糖酶基因(AKE23721.1)有98%的同源性。重组菌经优化培养,细胞破碎后上清液中的酶活力可达3.46 U/mL,是出发菌株Q5(2.05 U/mL)的1.69倍。经正交实验优化后的酶活力为4.99 U/mL。酶学性质研究表明:该酶的最适反应温度与pH值分别为50°C与pH 8.5,在pH 8.0和9.0保温48 h,其酶活力仍然维持到最高酶活的82%和81%;该酶在50°C以下较稳定,60°C以上酶活迅速降低。10 mmol/L的Ca~(2+)和Mg~(2+)对酶的活性有明显促进作用,重组酶Ega5的K_m和V_(max)分别是2.217 mol/mL和9.606μmol/(min·L)。该重组酶对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌具有显著抑制作用。【结论】本文首次从蠼螋肠道中筛选到了一株产碱性内切葡聚糖酶的细菌菌株并从中克隆出了一个碱性纤维素酶基因,为该酶在碱性条件的应用奠定了理论基础。     

适用于粉红粘帚霉绿色荧光标记的重组质粒的构建及应用

[目的]构建含有完整的绿色荧光蛋白(Green Fluorescence Protein,GFP)和潮霉素抗性基因的表达质粒,观察该质粒在丝状真菌粉红粘帚霉中的表达.[方法]采用PCR、酶切、去磷酸化、酶连、转化等多种分子生物学手段,利用原生质体制备及转化的方法将其转入机会真菌粉红粘帚霉中,并在荧光显微镜下观察表达情况.[结果]成功构建了用于真菌标记的真核表达载体pANGH3,将其转化粉红粘帚霉后,在荧光显微镜下观察到菌丝有绿色荧光产生.[结论]重组质粒pANGH3的成功建立及其在染粉红粘帚霉中的表达,为研究真菌侵染机理的模型奠定了实验基础.     

黏蛋白对气道黏液高分泌的抑制及其机制研究

制造黏液是一种维持肺部健康的主要防御机制,然而黏液中主要糖蛋白成份即黏蛋白的过量产生却是哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、囊性纤维化(CF)及肺癌的共同疾病特征.目前,以黏蛋白的过量表达与分泌作为靶标的治疗手段的研究刚刚起步.该文将讨论肺部黏蛋白基因表达及其表达产物释放到气道中的调控机制方面的最新研究进展,并提出抑制气道黏液高分泌的有效治疗策略.