外源木聚糖酶在枯草芽胞杆菌中信号肽筛选

[目的]本试验旨在筛选引导表达外源木聚糖酶基因高效分泌的信号肽,为枯草芽胞杆菌木聚糖酶高效分泌表达系统提供元件.[方法]构建信号肽筛选载体,载体是以含壮观霉素抗性基因的大肠-枯草穿梭载体为基本骨架,目标蛋白为耐碱性木聚糖酶,可在麦芽糖启动子Pglv诱导下表达.从枯草芽胞杆菌A1747基因组中扩增获得24个Sec途径信号肽,并将其全部链接到至筛选载体上,并在枯草芽胞杆菌WB700中实现表达分泌.重组菌在3%麦芽糖诱导下培养24h后用DNS法测定上清酶活.[结果]成功构建信号肽筛选载体pGPSX及24个表达载体,实现木聚糖酶表达分泌.且不同信号肽对于引导外源木聚糖酶分泌能力不同,其中YnfF信号肽引导分泌目标蛋白效率最高,上清酶活为37.2IU/mL.[结论]试验证明在枯草杆菌中对外源蛋白进行信号肽筛选是提高其分泌的有效途径,并获得了针对木聚糖酶高效分泌信号肽YnfF.     

基于微卫星标记的苹果绵蚜种群遗传结构动态

【目的】苹果绵蚜是我国重要的入侵害虫,对苹果生产造成了严重危害。近年来,苹果绵蚜扩散面积增大,危害加重。了解苹果绵蚜入侵过程中的分子生态变化,可为该虫的综合防控提供依据。【方法】利用微卫星标记技术,选择6个微卫星位点对山东省6个地区(烟台、威海、青岛、潍坊、聊城、泰安)2012—2015年苹果绵蚜种群遗传结构变化规律进行分析。【结果】2012—2015年,山东省6个地区的苹果绵蚜遗传多样性随时间推移逐渐降低。其中,2012年的遗传多样性极显著高于2013—2015年;2013—2015年之间虽然差异不显著,但随时间推移,等位基因观测值(Na)和期望杂合度(He)等遗传多样性指数有逐渐降低的趋势。通过无限等位基因模型、双相突变模型和逐步突变模型分析发现,6个地区的苹果绵蚜均经历了瓶颈效应,是遗传多样性降低的主要原因。对6个微卫星位点分析发现,Erio20、Erio75和Erio78扩增到的苹果绵蚜等位基因数量以及这3个位点的多样性指数随时间推移逐渐降低。【结论】Erio20、Erio75和Erio78是引起苹果绵蚜遗传多样性降低的主要多态位点。苹果绵蚜可能进化出了"超级克隆"基因型,因此,其可在我国适应不同生态环境并增大扩散范围。     

生物素生物合成的研究

综述了大肠杆菌、球形芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中生物素生物合成操纵元基因的结构、转录和表达、基因的特点和作用,以及实验室条件下生物素操纵元的表达情况,并对宿主菌的生长抑制现象作了概述。     

三维打印羟基磷灰石/磷酸三钙骨支架工艺中粉体材料组分比及黏结剂对骨支架性能的影响

笔者研究了胶水选用及粉材组分对三维打印羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/β-TCP)骨支架性能的影响。为了改善骨支架的力学性能和生物兼容性,分别选用磷酸和聚乙烯醇作为黏结剂,使用Zprinter 250三维打印机制备了不同HA/β-TCP质量配比(100∶0、80∶20、60∶40及40∶60)的骨支架。通过孔隙率测量、吸水性实验、抗压强度试验、电镜扫描及细胞培养等多种实验方法,分别从连通性、微观结构、表面特性、力学性能及生物兼容性等方面分析了不同胶水及组分比例制备的骨支架性能。结果表明:使用磷酸作为黏结剂的骨支架,不论从微观结构还是生物兼容性和力学强度,其性能均优于聚乙烯醇制备的骨支架。当粉材中HA与β-TCP的比为60∶40时,磷酸骨支架抗压强度取得最大值(4.8 MPa),此时其弹性模量为200 MPa,此外,细胞培养实验表明HA与β-TCP的比为60∶40的磷酸骨支架在促细胞增殖生长方面的表现也最优。因此,后续的临床试验中可选用磷酸作为黏结剂,而HA与β-TCP比为60∶40的骨支架更能促进细胞的生长和增殖。     

靶向小衣壳蛋白L2的具有广泛保护性的VLP型HPV疫苗的临床前优化

正理想的预防人类乳头瘤病毒(HPV)疫苗应该具备以下特性,即能够提供广泛的保护性和持久的免疫应答,能够应对所有高危人乳头瘤病毒类型,单一剂量注射后即产生免疫效果,在无需制冷的条件下能够长期保存。基于以上要求,作者已经研制出由噬菌体病毒样颗粒(VLPs)组成的HPV候选疫苗,该噬菌体病毒样颗粒具有广泛的HPV16次要衣壳蛋白L2来源的中和表位。免疫接种16L2 VLPs     

糯玉米SW70和SW22是一类新的淀粉合成酶基因功能缺失多突变体

糯玉米是一类相对于粮食玉米的重要天然突变体,其淀粉合成的遗传机制复杂而又多样。以糯玉米自交系5形22、普通玉米自交系5003、SW22（♀）和5003（♂）的杂种定向选育的糯玉米自交系SW70（自交4代）为材料,研究了自交系授粉后1、2、4周时,SW22、SW70和5003籽粒中ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、淀粉合酶（SS）、淀粉分支酶（SBE）和淀粉去分支酶（DBE）共4个家族21个成员编码基因表达水平的变化。结果表明：1）SW22中多个淀粉合成酶编码基因的表达动态与SW70及5003中有显著差异。差异主要存在于淀粉合酶SS和淀粉去分支酶DBE基因家族：2）SW22及SW70籽粒中有明显的阢转录产物累积,但累积水平均显著低于5003籽粒中：3）SW22及SW70中颗粒结合淀粉合成酶编码基因Gbssm和异淀粉酶型去分支酶编码基因Iso2完全不表达．意味着SW22胚乳中GbssIIb基因和Iso2基因的功能完全缺失。目前,有关玉米籽粒中GbSSIIb和异淀粉酶型DBEIso2同时突变或单个基因突变均未见报道。推测淀粉合成酶基因GbssIIb和异淀粉酶型DBEIso2功能缺失以及耽功能部分缺失．共同导致了SW22和SW70籽粒中直链淀粉合成部分缺陷。     

谷氨酰t-RNA还原酶基因（hemA）的高效表达

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中的hemA基因编码谷氨酰tRNA还原酶,该酶是B. subtilis代谢途径中由谷氨酸到5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）反应的限速酶。将B. subtilis的 hemA基因克隆到pET28a载体上,并在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,表达的目的蛋白占总蛋白的20%。通过分离纯化得到谷氨酰tRNA还原酶。重组菌发酵液上清中5-ALA含量达40.2 mg/L,菌液呈红色,过筛试验和紫外分光光度检测验证显色物质为卟啉类,实验表明,表达的重组蛋白促进了5-ALA的合成和代谢。     

沈阳市铁西区老工业搬迁区土壤多环芳烃的健康风险评价

采用美国能源部风险评估信息系统的暴露量化方法和美国环保局健康风险评估手册的风险表征方法,评估了沈阳市铁西区老工业搬迁区土壤中15种多环芳烃对户外劳作者的健康风险.沈阳市铁西区老工业搬迁区土壤中多环芳烃含量为290.9～8492.37μg·kg-1,搬迁区户外劳作者由于土壤中多环芳烃引起的非致癌危害指数范围为6.39×10-6 ～ 3.04×10-4,致癌风险范围为2.08×10-7 ～7.52×10-6,可判定对人体健康的危害较小.沈阳市铁西区老工业搬迁区致癌多环芳烃含量最高暴露点致癌风险值为7.52×10-6,未超过致癌风险水平上限(10-4),致癌风险尚在可接受范围内.多环芳烃中苯并(a)芘对综合致癌风险贡献最大,贡献率高达61.0％,应注意防范土壤中该污染物引起的健康危害.沈阳市铁西区老工业搬迁区户外劳作者受到的非致癌危害和致癌风险主要由经口摄入途径和皮肤接触途径贡献,两种途径对非致癌危害和致癌风险贡献率分别达到99％和100％,呼吸摄入引起的非致癌危害和致癌风险则相对较小.     

大肠杆菌、枯草杆菌穿梭表达载体的构建及改造

将大肠杆菌的复制子rep和多克隆位点克隆到枯草杆菌质粒pGDV1的骨架上,即得到大肠杆菌枯草杆菌牙梭庾粒载俸pGDVM。在pGDVM上进行载体表达元件的构建,先后将P59启动子、核糖体结合位点SD和终止子克隆到pGDVM上得到穿梭表达载体GJ01。以β-半乳糖苷酶基因（bga）作为报告基因检测载体的表达活性,在大肠杆菌和枯草杆菌中β-半乳糖苷酶（Bga）酶活性最高达到75.3和83．2个密勒单位,表明所构建的表达载体具有较强的表达能力。以核糖体结合位点（SD、SD3、SD4和SD5）代替表达载体GJ01-bga中的SD,对载体进行改造。所构建的GJD2-bga在大肠杆菌中的最大酶活性为253．8个密勒单位,G]D5-bga在枯草杆菌中的最大酶活性为135．4个密勒单位,表明所构建的载体具有较强的表达活性。由此可以得出不同的SD序列及其与起始密码子的距离不同程度地影响mRNA的翻译效率。