proUK-KGDW融合基因在CHO细胞中的高表达

利用常规分子生物学技术,构建了新型高效的proUK-KGDW融合基因的分泌型哺乳动物细胞表达载体。将该载体线性化后转染CHO/dhfr-细胞,经G418筛选获得阳性克隆,然后挑取表达水平较高的克隆进行MTX加压扩增,以提高proUK-KGDW杂合体的表达水平,经2～3轮MTX加压扩增,获得多株表达水平超过10μg/(106细胞·24h)的稳定的高表达细胞株,为proUK-KGDW杂合体的制备及功能研究奠定了基础。     

日本脑炎病毒C蛋白对其复制子载体自主复制活性的影响

为了研制具有高效自主复制能力的日本脑炎病毒 (JEV) 复制子载体,验证其作为新型复制子疫苗载体的可能性。以保留全长核心蛋白C基因的JEV复制子载体pCTCJEV为基础,通过PCR的方法减短C蛋白的部分基因序列,分别保留C23和C68位氨基酸,以Lac Z基因作为报告基因,构建了C基因长短不同的JEV复制子载体pCMW-2M-1LACZ、pCMW-2M-3LACZ。将复制子载体转染表达JEV结构蛋白的细胞系CME-4,通过Lac Z的表达检测JEV复制子载体表达外源蛋白的能力,反映了JEV的系列复制子载体的自主复制能力。结果保留C基因全长,C68、C23的复制子载体表达外源蛋白的能力相当,以上结果说明仅仅保留C蛋白的69个核苷酸即可保留JEV复制子载体的自主复制能力,为进一步优化JEV复制子载体,将该载体开发研制成为高效表达外源蛋白的疫苗载体提供了依据。     

B型肉毒毒素受体结合区C片段在大肠杆菌中的表达及免疫原性研究

目的:在大肠杆菌中表达、纯化B型肉毒毒素受体结合区C片段(BHc-C),研究其免疫原性。方法:将BHc-C基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达GST-BHc-C融合蛋白并通过亲和纯化;以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备免疫血清,采用ELISA检测免疫血清的效价并测定其抗B型肉毒毒素中和活性。结果:在大肠杆菌中表达了GST-BHc-C融合蛋白;以该融合蛋白免疫小鼠获得高效价免疫血清,且该免疫血清具有中和活性。结论:获得了GST-BHc-C融合蛋白,并证实其具有免疫原性。     

重组单链抗体-低分子质量尿激酶融合蛋白在 CHO 细胞中的抗降解研究

抗人纤维蛋白单链抗体-低分子质量尿激酶(Ⅱn-UK)融合蛋白,兼有单链抗体对纤维蛋白的亲和性和尿激酶的溶栓活性,有望开发成为新型导向溶栓药物.但基于通用连接肽(G4S)3的Ⅱn-linker-UK融合蛋白在CHO细胞中表达时出现明显的降解.为了解决此问题,利用分子生物学方法,对Hn-UK融合蛋白进行了分子改造,包括置换连接肽,改变两个半分子(moiety)的相对位置,以及对连接肽附近明确的蛋白酶位点进行突变等方法,并分别研究了改造后的11种Ⅱn-1inker-UK或UK-linker-Ⅱn突变体在CHO细胞中分泌性表达时的稳定性,最终筛选到一种抗降解的突变体.     

定点整合人Bcl-2基因的CHO/dhfr-细胞株的建立

构建重组载体质粒pMCEfrt—Bcl-2,利用FIp—In^TM定点重组系统,在CHO—dhfr^-细胞内定点整合人Bcl-2基因,通过Western印迹检测重组细胞Bcl-2蛋白的表达。通过流式细胞仪和DNA Ladder检测在高NH4C1条件下细胞的凋亡情况;用台盼蓝染色检测在无血清IMDM培养基中细胞的活细胞数目和活细胞比例。结果获得了稳定表达Bcl-2基因的细胞株CHO—Bcl-2,该细胞株能高水平表达Bcl-2蛋白。在无血清培养过程中,CHO—Bcl-2细胞比对照细胞保持高约15％的活细胞比例,细胞总数高25％。CHO-Bcl-2在高NH4^＋（50mmol／L）培养条件下具有较低的凋亡水平。建立了能够高表达Bcl-2基因并具有一定的抗凋亡能力的重组CHO／dhfr^-细胞株。     

日本脑炎病毒SA14-14-2 E蛋白结构域Ⅲ的抗原性和免疫原性分析

为了表达日本脑炎病毒囊膜蛋白(E蛋白)结构域DⅢ区,了解其作为亚单位疫苗的可能性,本研究根据SA14-14-2病毒株序列(GenBank Accession No.D90195)设计两条引物,以全长JEV感染性克隆pBR-JTF为模板,通过PCR扩增出JEVE蛋白DⅢ的cDNA片段,构建了原核表达载体pET-JEDⅢ,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行融合表达。融合蛋白为可溶性表达,表达量约占菌体蛋白的75%。用纯化后蛋白免疫新西兰兔和BALB/C鼠,通过ELISA,Western blotting,噬斑减少实验,及乳鼠攻毒实验验证JEDⅢ的抗原性和免疫原性。Western blotting及ELISA结果表明纯化后的表达产物具有良好的抗原性,纯化的JEDⅢ蛋白免疫新西兰兔,可以获得高达1:7×105滴度的抗JEV特异性抗体;JEDⅢ蛋白免疫BALB/C鼠,可以获得1:8.2×104滴度的抗JEV特异性抗体。并且获得1:256滴度的中和抗体,乳鼠攻毒实验能达到75%的保护效果。以上结果说明本研究表达、纯化的重组JEDⅢ蛋白,免疫小鼠以及兔后,能产生抗JEV的特异性抗体,中和性抗体,能够保护部分乳鼠接受毒...